使用了以下试剂和试剂盒：硫酸铵（Sigma ，09913）；BSA解决方案（Sigma，A1595）;Chromium Next Gem单细胞多组ATAC+基因表达试剂盒（10x基因组学
，PN-1000283）;康宁猎鹰细胞滤网（Corning，08-771-2）；Dithiothreitol（Thermo ，R0861）;EDTA
，pH 8.0 RNase-Free（Invitrogen，AM9260G）;KCl（2 M）RNase-Free（Invitrogen ，AM9640G）;MACS SmartStrainers（Milteny Biotec
，130-098-458）;Merscope 500基因成像套件（Vizgen，10400006）;Merscope 500基因面板（Vizgen ，10400003）;Merscope样品准备试剂盒（Vizgen
，10400012）;N，N ，N'
，N'-四甲基二胺（Sigma，T7024-25ml）;NaCl（5 m）RNase-Free（Invitrogen ，AM9759）;NP40（Igepal CA-630）（Sigma，i8896）;多聚甲醛（Sigma
，F8775）;PBS（10×）pH 7.4 RNase-Fime（Thermo Fisher，AM9625）;蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma ，P9599）；保护剂RNase抑制剂（Sigma
，3335402001）;Scigen Tissue-Plus Oct Compound（Fisher，23-730-571）;精子（Sigma ，S2626）;精子（Sigma
，85590）;Triton-X（Sigma，93443）;和Ultrapure 1 M Tris-HCI缓冲液pH 7.5（Invitrogen ，15567027） 。 　　在这项研究中强调了以下基因：ALD1（agd2样防御反应蛋白1
，AT2G13810）；BCA2（β碳酸酐酶2； AT5G14740）;BON3（BONZAI 3; AT1G08860）;Cbp60g（钙调蛋白结合蛋白60类g; at5g26920）;FDH（Fiddlehead； AT2G26250）;FMO1（依赖黄素依赖性单加氧酶1; AT1G19250）;GT-3A（Trihelix DNA结合因子（GT因子）结合3A； AT5G01380）;ICS1（等位置异性合酶1; AT1G74710）;LSD1（病变模拟疾病1; AT4G20380）;HSFB2B（热休克转录因子B2B； AT4G11660）;ILL6（IAA-达氨酸抗性（ILR）类基因6; AT1G44350）;MAM1（甲基硫烷基甲酸合酶1; AT5G23010）;WRKY8（AT5G46350）;和WRKY46（AT2G46400）。 　　A. thaliana col-0在22°C的腔室中生长，光照周期为12小时 ，相对湿度为30-31天
。在28°C的King的B液体培养基（利福平和四环素）中培养细菌菌株。三种细菌菌株-p 。Syringae PV
。番茄DC3000带有空载体（PLAFR3）
，AVRRPT2（PLAFR3）和AVRRPM1（PLAFR3） - 先前已经描述了9,10,11。通过离心收集细菌，并将无菌水重悬于0.001的OD600（约5×105 c.f.u. ml -1） 。总共使用无针注射器将20个A. thaliana叶（每植物4个完全膨胀的叶子）用细菌悬浮液注射
。在每个叶子的一个或两个角上进行注射浸润 ，并将细菌悬浮液分布在整个叶片中。我们选择了四个不同的时间点（4 、6、9和24 h），代表感染的早期阶段
，以及在使用Bulk RNA-Seq40的先前研究中观察到动态转录重编程时 。对于每种菌株，通过在不同时间浸润细菌的同一时间在一天中的同一时间进行采样 ，以最大程度地减少昼夜节律的影响
。使用镊子收集20个感染的叶子
，并立即加工以提取核。对于模拟条件，在9小时后收集水浸入的叶子 。 　　PWAT206是A. Takeda的礼物
。使用HIFI DNA组件试剂盒（新英格兰生物群）构建以下质粒 ，并通过Sanger测序验证。Three PCR fragments were amplified from pBICRMsG41 using primer pairs (mEGFP-Nter_1_F plus mEGFP_1_R; mEGFP_2_F plus mEGFP_2_R; and mEGFP_3_F plus mEGFPNter_3_R) and were then assembled into StuI/AscI-digested pBICAscII42.使用引物对MEGFP_NTER_1_F PLUS MEGFP_4R和MEGFP_4F和MEGFP_4F加MEGFP_NTER_3R
，将所得质粒用作两个PCR反应的模板 。这些PCR产品被组装成Stui/ASCI消化的Pbicascii，产生了PBIC_MEGFP_NTER。使用MEGFP_CTER_F1 PLUS MEGFP_CTER_R从PBIC_MEGFP_NTER扩增PCR片段 ，然后使用MEGFP_CTER_F2 PLUS MEGFP_CTER_R来用作PCR的模板
。将所得的PCR片段组装到Stui/ASCI消化的PBIC_MEGFP_NTER中
，以获得PBIC_MEGFP_CTER。使用引物对GT3A_MEGFP_F加上GT3A_MEGFP_F加GT3A_MEGFP_R的GT-3A（AT5G1380）的编码顺序通过PCR放大，并组装到Stui-Digested PBIC_MEGFP_CTER中 ，以获得PBIC_GT3A_MEGFP 。使用引物对（35SP_HIFI_F和35STer_Hifi_R）从PBIC_GT3A_MEGFP扩增了编码羧基末端的MEGFP融合的GT-3A的序列
，然后将其组装到Xhoi/Xbai-Digigested PWAT206中
。如前所述43，使用PWAT206_GT3A_MEGFP使用tumefaciens GV3101（PMP90 ，PSOUP）对Thaliana Col-0植物进行转化，如前所述43。两种独立的抗BASTA抗性转基因系用于具有生物发光的丁香P. PV的细菌生长测定 。番茄DC300043应变和用于使用Higginsianum Maff C. c. higginsianum Maff 305635的病变发育分析
。在温度为22°C的气候室内生长植物
，相对湿度为60％，6,000 lux（约100μmolM – 2 S – 1） 持续10 h。将无菌水中的OD600 = 0.001的细菌悬浮液注射到4-5周大的植物的叶片中 。如前所述44 ，使用Glomax导航型灯泡发光器（Promega）测量细菌生长作为生物发光
。对于病变的发育分析
，用5 µL Higginsianum（每毫升1×105分生孢子）的5 µL分生孢子悬浮液降低了4-5周龄的植物的叶子。在气候室中，接种植物保持高湿度 ，温度为22°C
，光强度为6,000 lux 10小时 。使用ImageJ在接种后6天测量病变大小
。 　　GT3A-KO植物是通过使用CRISPR – CPF1进行基因组编辑而创建的。A. takeda提供了质粒PWAT235-CAS9-HF-CC 。使用引物对（SPEI-NLS-CPF1-F和BAMHI-NLS-CPF1-R;补充表2）从PY004（Addgene，69976）放大CPF1序列 ，然后通过SPEI和BAMHI消化。将消化的DNA片段连接到PWAT235-CAS9-HF-CC
，该片段被SPEI和BAMHI消化，导致PWAT235-CPF1-CC
。使用引物对GB-CCDB-F和GB-CCDB-R以及GB-U626-F和GB-U626-R从PWAT235-CPF1-CC从PWAT235-CPF1-CC放大了两个PCR片段。这些PCR片段和BSAI消化的PWAT235-CAS9-HF-CC使用HIFI DNA组装套件组装成单个质粒 ，从而导致PWAT235-CPF1-U626-CC-POLYT 。将两个寡核苷酸GT3A_GRNA2_F和GT3A_GRNA2_R杂交并结合到BSAI消化的PWAT235-CPF1-U626-CC-POLYT
，导致PWAT235-CPF1-U626-GT3A-GT3A-GRNA2-POLYT
。如先前所述的43，使用PWAT235-CPF1-U626-CC-POLYT使用A. tumefaciens GV3101（PMP90 ，PSOUP）转化A. thaliana col-0植物。在整个研究中，选择并使用了由于GT-3A基因中5 bp缺失而导致的过早停止密码子的转基因线 。 　　野生型植物的叶子和表达GT-3A-MEGFP的一种转基因品系在0.001的OD600时用水或DC3000注射
，并在渗透后24小时收集
。使用TRI试剂（Sigma）提取总RNA。使用BRAD-SEQ方法将一微克总RNA用于库制备，以创建链特异性3'数字基因表达库45 。在BGI的DNBSEQ-G400平台上对库进行了测序 ，该平台产生了100 bp的末端读取
。由于反向读取的质量由于poly（a）序列而较差
，因此仅使用正向读数进行分析。Trimming of the first 8 bases and adaptors and quality filtering were performed using fastp (v.0.19.7)46 with the parameters -x -f 8 -q 30 -b 50. The trimmed and quality-filtered reads were mapped to the Arabidopsis genome (TAIR10) using STAR (v.2.6.1b)47 with default parameters and transformed to a count per gene per library using featureCounts（v.1.6.0）48 。RNA-seq数据的统计分析是在R环境中进行的（v.4.1.3）
。由于Brad-Seq方法涉及聚（a）富集，因此排除了线粒体和叶绿体基因。分析中排除了平均读数计数少于10的基因 。使用软件包EDGER中的函数ColcNormFactor对所得的计数数据进行TMM归一化 ，然后通过limma软件包中的函数voomWithQualityWeights进行对数转换。对于每个基因
，使用Limma软件包中的函数LMFIT拟合线性模型
。对于p值计算中的差异，使用了limma封装中的eBayes函数。然后 ，通过使用软件包QVALUE中的函数QVALUE计算Storey的Q值
，从而校正所得的P值进行多个假设测试 。要提取表达显着变化的基因，Q的截止值< 0.05 and |log2-transformed fold change| >使用1
。 　　新鲜的核纯化缓冲液（NPB； 15 mM Tris pH 7.5
、2 mM EDTA ，80 mM KCl
，20 mM NaCl，0.5 mm的精子 ，0.2 mm的精子，1：100 BSA
，1：100 BSA和1：100蛋白酶抑制剂鸡尾酒）在实验之前并在冰上散发。所有随后的程序均在冰上或4°C上进行 。将20片叶子切成500–1,000 µl冷NPB，并用1：500的保护剂RNase在冰上剃须刀刀片进入5分钟以释放核 ，然后在20 mL NPB中孵育
。将细胞核的粗提取物通过70 µm和30 µm细胞滤网（70 µm
，康宁猎鹰细胞滤网，康宁 ，08-771-2; 30 µM
，MACS SmartStrainers，Milteni Biotec ，Milteni Biotec
，130-098-458）进行顺序过滤。将Triton-X和NP40添加到提取物中，每个浓度为0.1％ ，并在旋转时在4°C下孵育5分钟 。将悬浮液以50克离心3分钟
，在摇摆的旋转离心机至颗粒非核碎片中，并回收上清液
。通过在秋千连杆离心机中以500克离心5分钟 ，将核通过离心固定。当颗粒为绿色时，将颗粒重悬于20 mL NPBD（NPB为0.1％Triton-X和0.1％NP40）中
，通过移液量为1：1,000 Protector RNase，然后在500G下进行500g离心5分钟 。当颗粒是半透明的时 ，跳过了NPBD洗涤
。然后通过将其重悬于20 mL NPB中
，并在1：1,000的保护剂RNase中重悬于20 mL NPB中，并在500g的摇动 - 转子离心机中以500g的速度离心5分钟。将沉淀重悬于950 µL的1×核缓冲液（10x基因组 ，PN-2000207）中
，并在1:40 protector rNase和1 mM二硫代醇中重悬于 。将核的悬浮液以50克离心3分钟，在摇摆的转子离心机至颗粒非核碎片中 ，并回收上清液。此步骤又重复了一次
。使用血细胞计数仪手动计数所得的核。通过在秋千离心机中以500克离心5分钟
，将核固定在500克中，并去除上清液 ，然后去除上清液
， 留下大约10 µL缓冲液 。再次对核进行计数，并最多使用16,000个核用于后续步骤
。但是 ，在大多数样品中，我们没有加载10倍基因组学套件接受的最大核数
，以避免堵塞仪器的风险，这可能会导致样品中恢复的核数量变化（扩展数据图1B）。根据制造商的说明（10倍基因组学 ，CG000338）
，构建了SCRNA-SEQ和ATAC-SEQ库 。使用Illumina Novaseq 6000以双索引模式对SCRNA-SEQ库进行测序，其中有十个周期的i7和i5索引
。还使用Illumina Novaseq 6000在双索引模式下分别对SNATAC – SEQ库进行了测序 ，分别为i7索引和i5指数为8和24个周期。 　　处理序列数据
，以通过运行的CellRanger（V.6.0.1）和CellRanger-ARC（V.2.0.0）获得单细胞特征计数，分别用于SNRNA-SEQ数据和SNATAC – SEQ数据 。对于snRNA-seq ，使用–cinclude-Introns选项与使用Tair10基因组和Araport 11转录组构建的A. thaliana核转录组对齐
。从参考基因组中除去叶绿体基因组
，以分析SNRNA-SEQ和SNATAC-SEQ数据。A. thaliana Tair10基因组从https://plants.ensembl.org/下载，并手动删除了叶绿体基因组 。通过去除叶绿体基因并用连字符替换“ gene_name”柱中的半圆柱 ，用连字符在“ gene_name ”柱中替换半圆锥
，以防止在Cellranger-arc处理过程中进行错误，从而手动修改了A. thaliana Tair10基因注释文件
。我们注意到 ，在SNRNA-SEQ数据和SNATAC – SEQ数据中，平均将23.4％和26.0％的读数映射在叶绿体基因组上。从参考中去除叶绿体基因组不会影响整体RNA和ATAC计数分布 。使用R软件包Seurat（V.5）49和Signac50分析计数数据。 　　在集成数据集之前
，使用doubletfinder51预测双重运动集并进行过滤
。使用R package socrates52中的LoadedBedangeMedata函数的修改版本生成了SNATAC – SEQ的质量控制矩阵。使用以下参数使用MACS2（参考文献53）鉴定ACRS：-g（Genomesize）= 0.8E8，Shift = -50 ，Extsize = 100 = 100
，-QVALUE = 0.05， - nomodel ，-nomodel
， - nomodel， - keeppion -tup all 。计算了转录起始位点（TSS）下游2 kb或1 kb以内的读取映射的比例
。使用以下标准过滤核：200< RNA UMI count < 7,000; RNA gene count > 180; 200 < ATAC UMI count < 20,000; and fraction of RNA reads mapped to mitochondrial genome < 10%. Seurat objects of individual samples were merged using the Merge_Seurat_List function of the scCustomize package. 　　snRNA-seq clustering was performed using the R package Seurat. The cell-by-gene RNA count matrix was normalized using SCTransform. Dimension reduction was performed using principal component analysis with RunPCA. Technical variance among samples was reduced using Harmony54 using principal components (PCs) 1–20. Graph-based clustering was performed on the Harmony-corrected PCs 1–20 by first computing a shared nearest-neighbour graph using the PC low-dimensional space (with k = 20 neighbours). Louvain clustering (resolution = 1.0) was then applied, and the clusters were projected into an additionally reduced space using UMAP (n.neighbours=20 and min.dist=0.01). 　　Peaks were called independently on each cluster defined by snRNA-seq data and then combined using the CallPeaks function of Signac, which uses MACS2 with the following parameters: effective.genome.size=1.35e8, extsize=15, shift=−75. Peak counts were quantified using the FeatureMatrix function. Compared with the default peak calling pipeline of cellranger-arc (24,394 peaks), this cluster-specific peak calling approach was able to capture more peaks (35,560 peaks), which is consistent with a previous report50. 　　Dimensionality reduction was performed using latent semantic indexing (LSI)55. First, the top 95% most common features were selected using the FindTopFeatures function. Then, the term-frequency inverse-document-frequency (TF-IDF) was computed using RunTFIDF with scale.factor=100,000. The resulting TF-IDF matrix was decomposed with singular value decomposition with RunSVD, which uses the irlba R package. Technical variance among samples was reduced using Harmony with LSI components 2–10. Graph-based clustering was performed on the Harmony-corrected LSI components 2–20 by first computing a shared nearest-neighbour graph using the LSI low-dimensional space (with k = 20 neighbours). Louvain clustering (resolution = 0.8) was then applied, and the clusters were projected into an additionally reduced space with UMAP (n.neighbours=30L and min.dist=0.01). 　　The two modalities were integrated by weighted nearest-neighbour analysis using FindMultiModalNeighbors of Seurat with Harmony-corrected PCs 1–20 for RNA and Harmony-corrected LSI components 2–20 for ATAC. Then, SLM (resolution = 0.5) was applied and projected with UMAP (n.neighbours=30L and min.dist=0.1). 　　ATAC gene activity score was calculated using the GeneActivity function of Signac with extend.upstream=400. 　　LinkPeaks of Signac was used to call significant peak-to-gene linkage for each infection condition (mock, DC3000, AvrRpt2 and AvrRpm1). Background-corrected Pearson’s correlation coefficients between the gene expression of each gene and the accessibility of each peak within 500 kb of the gene TSS were calculated. A P value was calculated for each peak–gene pair using a one-sided z-test, and peak–gene pairs with P < 0.05 and a Pearson’s correlation coefficient of >0.05 were retained as significant links. 　　Motifs present in the JASPAR2020 database56 for Arabidopsis (species code 3702) were used. Cluster-specific peaks were first identified using FindMarkers of Seurat with default parameters. A hypergeometric test was used to test for the over-representation of motifs in the set of differentially accessible peaks using FindMotifs of Signac. Motif plots were generated using MotifPlot. Motif enrichment scores (motif deviation scores) of individual TF motifs in individual cells were calculated using chromVAR17. For the integration of motif enrichment scores and mRNA expression, motif names in JASPAR2020 were matched with gene names. Motifs that could not be uniquely associated with genes were removed from analysis. 　　To predict genes that are regulated by a TF, ACRs containing each TF motif were extracted. Then, genes for which expression correlated with these ACRs were identified. We considered genes within 5 kb from an ACR with a linkage score of >0.1作为重要的候选人。使用org.at.tair.db注释的clusterProfiler的富集功能 ，对每个TF进行了这些候选者的GO富集分析 。对于图2H中的分析
，应用了更严格的阈值（链接得分> 0.2）
。使用GGPLOT2（参考文献57）创建了GO富集图。 　　汇总具有相同亚集群标签的核，并计算了log2转录的成绩单（TPM）值 。从分析中删除了超过18,000个未发现基因的子截面
。对于通过过滤步骤的子频率子 ，使用具有K = 12的K-均值聚类聚类（使用肘部方法确定）（扩展数据图3B）。然后
，对每个群集中的基因进行了GO富集分析（扩展数据图3B） 。三个簇（1、5和8）显示了免疫相关功能的富集（对SA的响应）；这些簇中的基因被定义为“推定的免疫基因”，用于下游分析
。 　　为了计算假次 ，从snmultiome数据中获得了注释为叶肉叶的细胞的单元格基质。我们使用n_dcs = 2的函数scanpy.tl.dpt 。在模拟样品中用每个叶肉细胞用作起始细胞中的每个叶肉细胞构建了伪段轨迹。然后，将这些单独的轨迹平均在每个单元格中
，以创建一个统一的伪段轨迹
。通过使用PyGAM函数线性GAM与S（0，LAM = 400）拟合线性GAM来计算给定基因的热图基因趋势 ，以将GAM拟合到跨排序的假频率值中的RNA表达水平。 　　在Snmultiome数据中
，免疫活性叶肉细胞的子簇分别根据标记基因BON3和ALD1的表达来定义底漆和旁观者细胞簇 。通过比较这些细胞态，使用Seurat的Findmarkers函数鉴定了DEG
。在富含细胞状态的DEG的2 kb之内的ACRS上进行了基序富集分析。 　　为了评估CAMTA3在不同细胞状态下的贡献 ，首先使用已发表的Bulk RNA-Seq Dataset39鉴定了CAMTA3调节的基因
，并比较了野生型和Camta3-D（CAMTA3的主要负突变体） 。ETI（由AVRRPM1或AVRRPS4感染触发）抑制CAMTA3的基因与上面定义的细胞态DEG重叠
。进行高几何测试以评估重叠的重要性。 　　SnRNA-Seq在被AVRRPT2感染的GT3A-KO植物上进行，或在9和24 H.P.I.为每个感染条件准备了两种独立的重复 。使用与SNMultiome分析相同的标准过滤数据 ，而无需考虑ATAC – SEQ信息
。GT3A-KO SNRNA-SEQ数据与COL-0 SNMULTIOME数据（模拟和AVRRPT2条件）集成在一起
，并以与上述相同的方式进行了从头群集。根据免疫 - 基因表达，鉴定出免疫活性的叶肉簇并进一步取代 。从这些子截面中 ，分别根据标记基因BON3和ALD1的表达来定义底漆和旁观者细胞
。对于每个细胞态
，进行DEG分析进行比较Col-0和GT3A-KO植物以评估GT-3A突变的影响。 　　将我们的SNATAC-SEQ数据与已发表的成熟A. thaliana叶片激活模式触发的免疫（PTI），ETI或PTI和ETI以及非免疫活性叶片的成熟A. thaliana叶片的大量ATAC-SEQ数据进行了比较 。将批量ATAC -SEQ数据集中鉴定出的所有ACR合并 ，并将其与我们的SNATAC – SEQ数据集中确定的ACR进行了比较。 　　我们策划了500个靶基因，其中包括以下基因：（1）先前定义的A. thaliana叶片细胞类型的标记58；（2）涉及各种过程的基因
，例如免疫，激素途径和表观遗传调节；（3）先前使用DAP-SEQ（A TF – DNA相互作用测定）进行了多种TF 59
。基于Vizgen的探测器设计软件无法设计25个以上特定探针的基因被排除在目标基因面板之外。高度表达的基因可能导致Smfish信号过度拥挤 ，并阻碍Merfish定量 。为了避免在面板中包含高度表达的基因
，我们通过使用与当前研究在八个不同的时间点（1 、3
、4、6 、6
、9、12 、16和24 H）在同一研究的同一研究中使用公共可用的A. thaliana A. thaliana的公共大量RNA-seq数据集评估了靶基因表达
。对于每个基因，使用了八个时间点之间的最高表达值。在面板中未包括显示> 710的TPM值的基因 。500个基因的总TPM约为22,000
。ICS1是用一轮Smfish靶向的 ，因为该基因高度表达。没有定量信息作为图像提供Smfish结果 。通过将19个高表达基因（基于先前在Planta Bulk RNA-Seq Data60中发表）作为单个靶标而可视化细菌细胞
。补充表1具有Merfish靶向的基因列表。所有探针均由Vizgen设计和构建 。 　　根据上述方法生长植物
。切除与上述处理的叶子
，并在OCT（Fisher）中立即孵育和适应时间点5分钟。孵育后，如前所述61立即冷冻叶子 。在预冷的低温恒温室（Leica）中 ，将组织块适应于-18°C 1小时。修剪组织块直到达到组织为止
，然后检查10 µm的切片，直到暴露了感兴趣的区域
。根据MERSCOPE用户指南进行样品安装和准备工作 ，但进行了轻微的修改。简而言之
，将10 µm的截面融化，并安装在室温的Merscope载玻片上（Vizgen ，20400001），放入60毫米的培养皿中
，并在低温恒温室中孵育5分钟 。随后的步骤用培养皿中的安装样品进行
。然后在37°C下烘烤样品5分钟，并在固定缓冲液（1×PBS和4％甲醛）中孵育15分钟。然后将样品用1×PBS洗涤 ，其中包含1：500 RNase抑制剂（保护剂RNase抑制剂
，Millipore Sigma）在室温下三分一度地洗涤5分钟 。在最终的PBS洗涤后，将样品通过在4°C的70％乙醇中孵育过夜 ，将样品脱水
。 　　根据Vizgen的规程处理组织切片。去除70％乙醇后
，将样品在样品预备洗涤缓冲液（PN20300001）中孵育1分钟，然后在37°C的甲酰胺洗涤缓冲液（PN20300002）中孵育30分钟 。去除甲酰胺洗涤缓冲液后 ，将样品在37°C的Merscope基因面板混合物中孵育42小时
。探针杂交后
，将样品用甲酰胺洗涤缓冲液在47°C下洗涤两次，持续30分钟 ，然后在室温下用样品预先洗涤缓冲液进行2分钟。洗涤步骤后
，将样品通过在凝胶嵌入溶液（凝胶嵌入溶液（PN20300004），10％（w/v）过硫酸铵和N ，N，N
，N'，N' ，N'-四甲基甲基二胺）处在室温下为1.5 h 。然后
，首先将样品在室温下在消化混合物（消化前胞体（PN 20300005）和1:40保护剂RNase抑制剂）中清除2小时，然后在47°C下在47°C下在47°C下在47°C下在47°C下在47°C下孵育2小时 ，然后在47°C下孵育
。将清除的样品用样品预备洗涤缓冲液洗涤两次
，并在室温下用DAPI和Polyt染色试剂染色15分钟。然后，将样品用甲酰胺洗涤缓冲液在室温下洗涤10分钟 ，然后用样品预备洗涤缓冲液冲洗 。使用Merscope仪器对样品进行成像
，并使用Vizgen生成的代码簿在Merscope仪器上解码检测到的成绩单。使用Vizgen的可视化器可视化笔录
。 　　对每个Merscope数据输出进行细胞控制分割。靶向DAPI靶向和聚（A） - 靶向探针分别在染色核和细胞质方面表现出可变的成功，具体取决于所检查的样品和组织区域（图3B和扩展数据图7E显示出失败和成功的分割） 。相比之下 ，密集的转录区域标记了核位置的位置更加牢固（扩展数据图7E）
。因此
，使用了基于转录本的分割方法。对于每个样品，生成了二维的零阵列 ，生成了零的零阵列，该阵列对成像的总像素区域进行了建模 。在此数组中
，已识别的RNA转录本的坐标从0更改为1
。接下来，使用ksize =（5,5）的openCV中的cv2.gaussianblur函数对数组进行模糊。由此产生的阵列分为2,000×2,000像素区域 。这些区域被加载到Cellpose62中 ，该区域是一种基于深度学习的分割工具
，并通过手动分割核对象进行培训，该模型在细胞pelpose GUI中的10个2,000×2,000像素区域中进行了分割
。 　　然后使用自定义模型预测所有其余区域中的分割边界 ，参数直径= 22.92
，flow_threshold = 0.7和单元格概率阈值= -2。接下来，通过将所有区域的独特细胞数量求和 ，计算了一个实验中的细胞总数 。然后
，该数字被用来在另一个分割工具Baysor63中初始化-num-cells-init命令，该命令认为转录组成和细胞形态的关节可能性以预测细胞边界
。Baysor was run using a downloaded Docker image and parameters -s 250, --n clusters 1, -i 1, --force-2d, min-molecules-per-gene=1, min-molecules-per-cell=50, scale=250, scale-std=“25%
”, estimate-scale-from-centers=true, min-molecules-per-segment=15,新组件重量= 0.2 ，new Component-Fraction = 0.3。 　　为了测试基于成绩单的分割方法的质量
，我们使用了带有成功DAPI染色的FOV（在我们的样品中很少见），并进行了基于DAPI的分水岭分段和基于转录本的分割（扩展数据图7D） 。这两种分割策略的结果一般彼此一致 ，基于转录本的方法捕获了细胞质中的转录本以外的成绩单（扩展数据图7D – F）。该结果表明我们的分割方法可以可靠地捕获细胞
。 　　Baysor分割后，从转录单元分配创建了一个单元格基质。去除少于50个分配的转录本的细胞 。Scanpy用于后处理我们的Merfish实验
。为每个实验将各个单元格矩阵加载到Anndata对象中后
，我们存储了从Baysor获得的每个细胞的空间坐标。每个细胞中的单个转录本计数通过每个单元的转录计数总数进行标准化 。然后对Anndata单元格矩阵进行对数尺度
。 　　为了将Merfish实验彼此集成，我们使用了Find Integrationanchors ，然后使用Seurat（V.5）中的IntegratedAta函数。为了将Merfish实验数据与我们的SNMultiome数据集成在一起
，我们分别将相应的时间点集成在一起 。对于感染数据中的每个时间点（模拟，4
、6、9和24 h） ，我们使用scvi-tool的gimvi使用其RNA表达计数将SNMultiome和Merfish细胞投射到同一潜在空间中
。Gimvi接受了200多个时期的训练
，每个时间点具有10尺寸的潜在空间。为了将连续观测（伪观，RNA和ATAC基因活性计数以及基元富集）从snmultiome数据传递到Merfish数据 ，我们为每个Merfish细胞分配了GIMVI潜在空间中最接近30个Snmultiome细胞的数值平均值 。同样
，为了传递包括细胞类型和簇标签在内的分类观测值，我们将每个Merfish细胞分配给其30个最近的Snmultiome细胞集中最常见的标签
。为了在一个时间点绘制两种方式（Merfish和Snmultiome）的关节嵌入 ，我们在n_neighbors = 30的GIMVI潜在空间上运行了UMAP
，Min_dist = 0.1。请注意，在Snmultiome中预测的细胞类型的空间映射中（图4C） ，尽管该部分位于叶子的中间，但包括一些表皮细胞
，因为该截面并不完全平坦 。 　　使用python软件包进行大型鱼类的量化量子标记的转录本。通过使用numpy.max沿Z轴，将七个Z平面的Merscope Smfish图像投影到了两个维度 ，并分为2,000×2,000个区域
。然后使用函数bigfish.detection.detect_spot = 50
，spot_radius =（10，10）和voxel_size =（3 ，3）调用斑点。为了识别细菌菌落
，bigfish.detection.detect_spots被要求标记阈值= 200，log_kernel_size =（1.456 ，1.456）和minimum_distance =（1.456
，1.456）的“细菌元基因”位置 。为了说明植物组织的自荧光，使用了同一点呼射器在DAPI和ICS1通道上呼叫斑点
。所有三个通道的斑点均汇总 ，并且来自Scikit-learn.Cluster的DBSCAN均在EPS = 35和min_samples = 5的所有斑点上使用。我们保留了所有DBSCAN簇
，DAPI和ICS1斑点不到总簇点的30％ 。这些剩下的簇代表了潜在的细菌菌落
。我们手动评估了每个集群，以合并标记相同菌落的群集并去除标记明显自动荧光的簇 ，例如来自气孔的信号。在每个最终群集周围生成了300×300像素的窗口，并使用detect_spots的阈值= 95
，spot_radius =（17，17）和voxel_size =（3 ，3）
，以准确地量化每个群集的单个细菌 。 　　为了确定每个细菌菌落周围邻域的免疫水平，我们确定了与菌落接近的1-1,000个最近的细胞
。然后 ，将这些相邻细胞的平滑估算值值进行平均
，以获得每个邻居大小的单个平均伪频率值。使用标准误差除以每个邻域大小的平均值来计算误差曲线 。这些值是每个菌落周围面积的总体免疫水平的指标
。 　　为了鉴定与免疫丰富区域相关的基因（与图5A相关），我们首先在空间最接近的100个细胞上平滑了估算的空间假次 ，以找到免疫活性热点的区域。然后
，我们使用rctd64使用SNMultiome数据中的单元格类型在我们的空间数据中解析双重脉冲，作为参考 。我们创建了一个具有min_umi = 15的参考对象 ，并在我们的Merfish数据上rctd rctd使用参数gene_cutoff = 0.0001
，gene_cutoff_reg = 0.0001，fc_cutoff = -3 ，fc_cutoff_reg = -3和doublet_mode ='doublet'。然后，我们使用cell_type_threshold = 0的run.cside.single运行SpaceXR的C-side20
，以沿着平滑的空间假节（解释性可变）找到顶部的每个细胞类型的顶部空间差异表达的基因，并绘制了负模式转换的P值 ，而对数转换的折叠折叠变化
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
http://http://www.o-press.com/news/show-84.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8126.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-214.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8353.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-188.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8114.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8390.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8075.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8283.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8103.html/sitemaps.xml