在12 h的光/12小时黑暗周期下 ，将苍蝇保持在25°C和50–65％的相对湿度 。D. Melanogaster股票Canton-S（目录号64349），UAS-GCAMP6S（42746和42749）
，UAS-MCD8 :: GFP（5137），71G01-GAL4 ，GAL4（39599）
，FRUELULEXA（66698）和UAS-CSCHRIMSON和UAS-CSCHRIMSON（55134）布卢明顿股票中心。Lexaop-SPA-T2A-SPA是在先前的研究中产生的
。19。D. Yakuba Ivory Coast（14021-0261.00），D 。Erecta（14021-0224.01）和D. Ananassae（14024-0371.34）从Cornell（以前是UCSD）股票中心获得
。D. Eugracilis（SHL12）是从京都股票中心获得的。果蝇铃木（WT3）（L. Zhao ，洛克菲勒）;D. Melanogaster Splitp1-Gal4（D. Anderson
，加州理工学院）；D. Melanogaster Frugal4和Fruad/Frudbd（B. Dickson，Janelia Research Campus）；D. Melanogaster PPK23-GAL4（K. Scott ，UC Berkeley）；D. Yakuba Frugal4
，Frudbd和Fruad Inserts62，71G01-GAL4（参考文献63） ，UAS-GCAMP6S
，UAS-CSCHRIMSON，UAS-KIR2.1和ATTP1730（D. Stern ，D 。Stern，Janelia Research Campus）；D. ERECTA 71G01-GAL4（第5号插入）
，D
。勃起uas-gcamp6s（插入第5号），D。erecta uas-cd8 :: gfp（插入号2） ，D 。erecta uas-cschrimson :: tdtomato（宾夕法尼亚大学丁；D. Yakuba UAS-MCD8-GFP（插入编号2＆3）
，UAS-GFP（插入第8号），UAS-SPA-GFP（插入第2号） ，PPK23-GAL4（插入NO.2）
，PPK23 Mutant，PPK25 Mutant ，PPK25 Mutant和Or67d Mutant是此研究
。有关详细的基因型
，请参见补充表1。 　　IE1.MCHERRY和IE1.EGFP微型记者用作转换标记的构建以下片段：IE1启动子是从PBAC {orco.qf，quas.gcamp ，ie1中放大的 。dsred}（摘自D. Kronauer的礼物）
，果蝇密码子优化的麦克利和EGFP基因块（IDT），并从pjfrc81（Addgene ，36432）中扩增P10-3''未翻译区（UTR）
。然后将它们用吉布森组装（NEB）克隆到PBAC {3xp3-EGFP，PACTIN-PTRSP}（Addgene
，86861）之后，在使用BSTZ17I和BSU36I进行摘要之后 ，以生成PRC7A（IE1.MCHERRY）和PRC10A（IE.EGFP）。 　　为了在PRC10A中创建一个更灵活的多键盘站点
，一个包含以下限制酶站点的GBLOCK（IDT），HPAI ，Hincii
，Hindiii，hindiii ，kpni
，noti，noti ，Xhoi
，Xbai，Xbai和Fsei ，由Gibson组成并通过PRCSONBLEBLENBLENE合成并加入 。最终的向量为PIM145。然后将MCHERRY用NHEI和HPAI从PRC7A克隆到PIM145骨架上，代替GFP生成PIM148
。 　　为了产生P1驱动线
，从D. melanogaster基因组DNA中扩增了PGMR71G01中存在的VSX2基因的3,844 bp片段。然后，吉布森集会将其克隆到GAL4基因块（IDT）前的PIM145的骨干中 ，生成PRC12B 。 　　为了产生含有UAS-GFP的BAC矢量
，​​从PJFRC81（Addgene，36432）中切除了以下盒式10×UAS-IVS-SYN21-GFP P10 UTR ，并用Hindiiii和FSEI删除
，并将其连接到PIM145中
。最终的向量为PIM153。 　　为了生成含有UAS-SPA-GFP的BAC矢量，​​将果蝇密码子优化的SPA-GFP合成为GBLOCK（IDT） ，并由Gibson Assembly（NEB）克隆到PIM147中
，代替GCAMP6S，以代替GCAMP6S ，以生成PIM141 。 　　为了生成PPK23-GAL4
，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）净化野生型D. Yakuba基因组DNA
。首先，收集了50毫克的苍蝇 ，并在液氮中捕捉冻干。使用砂浆和杵将苍蝇磨成细粉 。将粉末转移到微量离心管中，并根据Dneasy血液和组织套件的说明进行处理
。所得的基因组DNA用作PPK23启动子PCR扩增的模板。将2.7 KB启动子克隆到PRC12B中以生成PIM169 。 　　为了生成包含蓝色荧光标记的BAC矢量
，​​合成了果蝇密码子优化的MTAGBFP2
。由于MTAGBFP2的序列复杂性，它被设计为两个重叠的gblocks（IDT） ，并将无缝组件的IE1启动子的一部分包括在目标向量中。MTAGBFP2由Gibson Assembly（NEB）克隆到PIM148中
，代替MCHERRY生成PIM149 。 　　设计了两个单个引导RNA（SGRNA），以将Cas9介导的裂解引导到D. Yakuba中PPK23基因基因座的第一个外显子和3'UTR。使用CRISPR最佳目标查找器（http://tools.flycrispr.molbio.molbio.wisc.edu/targetfinder/index.php）确定GRNA非目标电位
。SGRNA序列 ，SGRNA1 catcggtgcggtcaCCGCAC和SGRNA2 GTGTTGCATACTTAGCGGCG被用Q5高效率Master Mix（NEB）放大
，并通过Gibson组件（Nebbly（Neb）克隆到PCFD4中（Addgene，49411）。最终的载体为PIM179 。PIM148被HPAI和SMAI消化以解放IE1P MCHERRY P10 UTR
。然后将MCHERRY盒连接到PDSRED-ATTP（Addgene ，51019）
，该盒子被Agei和Bsiwi消化，以删除3×P3-DSRED盒 ，然后将其填充。这产生了PIM174 。从PPK23中预测的CAS9切割位点开始的1 kb同源臂用Q5高保真主混合（NEB）放大
，并将其克隆到PIM174中
。最终的向量为PIM175。使用标准注射程序将PIM179，PIM175和Cas9蛋白的鸡尾酒注入野生型D. Yakuba胚胎中 。可行的G0苍蝇与野生型雄性或处女雌蝇配对
。通过MCHERRY表达进行视觉筛选F1后代。麦克利阳性F1分别交叉到野生型雄性或处女雌性苍蝇 ，然后因基因组DNA而杀死 。通过使用内部和侧翼的靶向基因组区域的引物，通过基因分型来确认PPK23的缺失在MCHERRY阳性F1中得到了证实
。对基因分型的PCR产物进行了测序
，以验证确切的基因组修饰。来自序列验证的F1的MCHERRY阳性F2是自我分配的，MCHERRY阳性F3处女女性通过非致命方法进行基因分型 ，以鉴定纯合为PPK23缺失的雌性 。由于PPK23基因座位于X染色体上
，因此对PPK23无效突变的纯合雌性与男性半合子配合以产生稳定的线。 　　设计了两个SGRNA，将Cas9介导的裂解引导到D. Yakuba中的PPK25基因基因座的第一个外显子和3'UTR
。使用CRISPR最佳目标查找器确定靶标电势​​。SGRNA序列 ，SGRNA1 Gucggucgaugcaaccggac和sgrna2 Uaaacuuaacaacaacaucggag
，由Synthego合成 。从PPK25中预测的CAS9切割站点开始的1 kb同源性臂被命令为IDT的gblocks
。5'同源组中的PPK25启动代码从ATG突变为TTG。吉布森组装将同源臂依次克隆到PIM174中 。最终的向量为PIM188
。使用标准注射程序将PIM188，SGRNA1 ，SGRNA2和Cas9蛋白的鸡尾酒注入野生型D. Yakuba胚胎中。可行的G0苍蝇与野生型雄性或处女雌蝇配对 。通过MCHERRY表达进行视觉筛选F1后代
。麦克利阳性F1分别交叉到野生型雄性或处女雌性苍蝇
，然后因基因组DNA而杀死。通过使用内部和侧翼的靶向基因组区域的引物，通过基因分型来确认PPK25的缺失在MCHERRY阳性F1中得到了证实 。测序来自基因分型的PCR产物以验证精确的基因组修饰
。来自序列验证的F1的MCHERRY阳性F2是自我分配的 ，MCHERRY阳性F3处女雌性和雄性通过非致命方法进行基因分型
，以鉴定纯合子纯合PPK25缺失。 　　设计了两个SGRNA，以靶向起始密码子（SGRNA1）下游的22 bp和392 bp（SGRNA2）的下游D. Yakuba OR67D的终止密码子的下游 ，总共删除了1,783 bp的内源性DNA 。使用CRISPR最佳目标查找器确定脱离目标。sgrna1（gacuuuacgaaagcgcucca）和sgrna2（acugcugcuguccaaaggag）由Synthego合成
。使用Q5高效率主混合（NEB）从D. Yakuba基因组DNA扩增1,035 bp 5'同源臂，并使用XMAI和NDEI限制性酶克隆到PIM174中。使用Q5高效率主混合（NEB）从D. Yakuba基因组DNA放大了1,174 bp 3'的同源臂
，并使用AVRII和XHOI限制酶将其克隆到PIM174中 。最终的向量为PGK1
。使用标准注射程序将PGK1，SGRNA1/2和Cas9蛋白的鸡尾酒注入野生型D. Yakuba胚胎中。可行的G0苍蝇与野生型雄性或处女雌蝇配对 。如描述的其他突变体产生稳定线的所述 ，对后代进行筛选
，交配和基因分型
。 　　在施耐德的培养基（Sigma）中解剖成人大脑，然后立即转移到冷1％PFA（电子显微镜科学）中 ，并在4°C固定过夜。隔夜孵育样品在PAT3缓冲液（0.5％BSA/0.5％Triton/PBS pH 7.4）中洗涤3次 。在室温下
，将大脑在3％的正常山羊血清中被阻塞90分钟
。Primary antibodies 1:1,000 chicken anti-GFP (Abcam, ab13970), 1:50 mouse anti-brp (Developmental Studies Hybridoma Bank nc82), 1:2,000 rabbit anti-FruM (generated for this study by YenZyme against a synthesized peptide: HYAALDLQTPHKRNIETDV70) and 1:500 guinea pig anti-FruM (gift from D.Yamamoto，Tohoku University）在室温下孵育3小时 ，然后在4°C下孵育2-3天。大脑在PAT3缓冲液中广泛洗涤 。在室温下在室温下孵育3小时
，然后在4°C下孵育2-3天
。将大脑在PAT3缓冲液中洗涤3次，然后在PBS中洗一次。样品安装在Vectashield（矢量实验室）中 。使用Plan-Apochromat×20（0.8数值孔径）物镜在Zeiss LSM 880上捕获图像。 　　使用表达UAS-CD8 :: GFP的动物的天然荧光拍摄腿图像（插入2号）
。动物大约3-5天 ，将腿安装在Vectashield中
，并使用紫外线粘贴了股骨。图像以×25拍摄×1.6数字变焦 。 　　为了分析P1投影，使用计算形态学工具包（https://www.nitrc.org/projects/cmtk/）将图像注册到JRC2018M模板大脑中 ，并在VVD Viewer（https：//githubbub.com.com.com.comciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicciciccicciccicciccicciccicciccicciccicciccicc，g-一下约）和p1神经元进行了分段
。 　　所有单一选择测定均以25°C的速度进行
，在启动后0到3小时之间的相对湿度为50–65％。eClosion后不久收集雄性苍蝇，并在测定前饲养4-7天 。目标处女雌性是4-7天
。使用白光垫（Logan Electric）在4×4阵列后灯光中 ，在38毫米直径
，3毫米高圆形的斜坡壁板中进行测定。使用PowerShot SX620摄像头（佳能）或点灰色Flir grasshopper USB3相机（GS3-U3-23S6M-C：2.3 MP，162 FPS ，162 FPS
，Sony IMX174，单色）记录了飞行行为 。一名处女雌性被口吸入转移到房间 ，然后是一名测试男性
。一旦将雄性加载到腔室中
，分析就开始了，并记录了苍蝇的活性10分钟。请注意 ，在这些条件下
，没有对食物进行求爱测定，以避免苍蝇交配得太快 。在没有食物的情况下 ，雌性通常会更快地移动
。这导致男性求爱较短，这可能解释了与食物中的雄性相比
，黑暗中雄性在食物上观察到的回合长度的差异（也就是说，在食物上时 ，在黑暗中通常更长）。 　　在黑暗中进行的求爱测定在25°C下进行
，相对湿度为50-65％，在启动后0到3小时之间进行 。eClosion后不久收集雄性苍蝇 ，并在测定前饲养4-7天。目标处女女性为4-7天
。在35×10 mm2培养皿（Falcon）中对食物进行测定。通过口吸入将女性转移到室内
，然后是测试雄性 。一旦将雄性加载到腔室中，分析就开始了 ，并记录了苍蝇的活性3小时
。由于在黑暗中的求爱潜伏期很长
，因此延长的记录期是必要的，男性必须偶然发现女性。一个手动观察者记录了所有视频的求爱时间 ，然后使用10分钟进行分析 。红外发光二极管（LED）条（940 nm
，LED灯世界）背光均可进行测定
。使用点灰色Flir Grasshopper USB3摄像头（GS3-U3-23S6M-C：2.3 MP，162 FPS ，Sony IMX174，Monochrome）从室上方记录蝇行为。 　　对于所有行为实验
，通过初步研究评估方差，并选择了预定的样本量 。随机分组实验和对照动物的收集 ，同一天收集的数量大致相等
。求爱是通过使用机器视觉（MATLAB
，FlyTracker，Caltech）自动跟踪或手动对实验设置的观察者进行评分的（例如 ，物种
，基因型，香水处理）。为了手动分析 ，使用翼扩展
，追逐，安装和交配来评分求爱行为 。为了促进在日志刻度上绘制的所有0值均更改为0.1
。对于自动求爱得分 ，发现了8毫米IFD阈值
，最准确地捕获了盲目观察者评分的求爱，产生了最低数量的假阳性和负面因素。不幸的是 ，食物和/或红外照明的变化意味着，对于收集的大约一半的视频
，我们无法获得高质量的跟踪数据 。因此，我们选择跟踪一个随机子集 ，即
，可以从中可以从中进行质量跟踪的前12对。这提供了对求爱动态的代表性视觉评估，而所有求爱对的完整数据集是由盲目观察者手动评分的
。扩展数据图1说明 ，尽管IFD跟踪和手动评分的数据集在得分的绝对数量上有所不同
，但数据的总体趋势是一致的。但是，由于自动评分数据中的错误检测压缩了数据的动态范围 ，因此我们认为
，在黑暗中进行的测定中，回合长度是信息素依赖性求爱的最敏感的指标 ，有效地捕获了男性持续追求女性的能力
，并通过继续进行的信息符号反馈而引导 。因此，在所有数字中都使用了盲目观察者评分的回合长度
。在我们整个研究中使用此指标的唯一例外是：（1） 在对黑暗中求爱的初步分析（图1）中 ，在选择手动评分的求爱指标（扩展数据1）之前，将自动量化IFD进行了比较
，然后选择盲目的，手动的手动评分为最准确；（2）在D. melanogaster和D. Yakuba中P1亚型的光遗传学分析中 ，对求爱动态的更详细描述（图4A
，B和扩展数据图6A，B和7）以及因此 ，使用更精细的描述了Jaaba（Janelia）的行为分类
，以量化法庭和歌曲。（3）在扩展数据中，除了回合长度外 ，还绘制了更常见的求爱测量（例如
，法院的延迟，总百分比求婚）以提供全面的视图（扩展数据图3b – d ，4b d
，4b和8a，4b和8a ，c，c
，c，d ，f
，g） 。 　　通过跨雄性 +; prome（800）-gal4，tub-gal80ts; + flies; + flos to emair +; uas-Stingerii ，uas-hid/cyo；收集新近封闭的处女雌性
，并在25°C下保持1 d
。然后将雌性移至30°C 2 d，然后在使用实验之前在25°C下恢复2 d。筛选女性的GFP表达以证实卵母细胞的烧蚀12 。 　　OE-或D. Yakuba雌性的模拟 ，7-T和7,11-HD摄影
，分别在32毫米闪烁体（热舒适率）中添加2 µg 7-T或2 µg 7,11-HD（Cayman Chemicals）进行2 µg 7,11-HD（Cayman Chemicals）
。然后，将真空吸尘器从小瓶中蒸发。我们在每个小瓶上增加了5-8蝇 ，并以低速涡旋30 s
，三次 。通过将CVA溶解至乙醇中5 mg ml -1的浓度，可以使CVA调味料在灌输中
。然后 ，通过移液器将0.5 µL直接施加到每个苍蝇的腹部。在实验之前，所有蝇都归还给食物至少1小时 。 　　用于光活化实验
，frugal4用于表达SPA-GFP。对ECLOSITH后24-48小时的成年苍蝇进行光活化
。在925 nm处成像大脑，以鉴定合适的光标位点 ，而不会刺激光转换。然后
，使用Prairieview，通过将ROI短暂暴露于710 nm激光光中 ，在单个Z平面中刺激了感兴趣的细胞类型和光转换型特有的投影区域（ROI） 。在物镜的背部孔径的后孔径为5-35兆瓦
，具体取决于被转化的神经突的深度
。该过程重复50-100次，并用静止插入 ，以扩散光接收分子
，直到感兴趣的细胞类型均匀地超过荧光的背景水平。 　　所有成像实验均在带有驱动变色龙Ultra II TI：Sapphire Laser的仪表仪的Ultima两光激光扫描显微镜（BRUKER）上进行 。用GAASP光电二极管（Hamamatsu）检测器检测到发射的荧光
。所有图像均以512×512像素分辨率使用Prairieview软件（v.5.5）收集。使用斐济（V.2.14.0/1.54F）提取荧光时间序列 。如先前报道的13,19，进行了腹神经线和LPC制剂
。对于所有成像实验 ，将女性或男性刺激的呈现顺序随机化
，并再次提出了最强的反应刺激，以确认实验性男性的持续健康。样本量未预先确定 。 　　对于D. Yakuba P1成像 ，必须使用“ SplitP1 ”（71G01-AD 15A01-DBD交叉路口），而不是71G01-GAL4
，因为该线很弱，并且在实验完成之前进行了漂白
。这些分裂的动物在反应中显示出动物间的变异性。尽管在反应动物时 ，每次雄性在反应动物时
，只有大约5个（27只动物中的5个）表现出P1对种类的反应，但每当男性攻入同种女性时 ，反应是均匀的
，并且可以预见地诱发了（如图2所示） 。我们发现这可能是由于FRU -DSX+ P1子集的随机标记引起的。具体而言，SplitP1主要标记FRU+ P1神经元 ，并仅在某些动物中标记2-3个Fru -dsx+神经元
，如先前在D. melanogaster65中所示
。确实，当我们随后对DSX∩P1（71G01-DBD DSX-AD相交）进行成像时 ，未观察到动物间的变异性
，并且所有动物对每次TAP都对特异性做出了反应。当对LPC中的所有DSX+投影成像时，发现情况也是如此 。因此 ，为了简单和理解，我们只是在图2b中介绍了D. Yakuba Spitionp1雄性
。 　　对于每种GCAMP记录
，在LPC神经胶质中抽出ROI，其中轴突投射是P1最浓密的（如图2A中指示）或腹神经索神经索中PPK23+神经元具有其感官传递物（图3A中指示）。对于所有实验 ，在刺激呈现之前记录了3-5秒以创建基线 。然后对刺激前周期的20帧（约2 s）进行平均以确定基线荧光（F0）
，然后计算为Δft/f0 =（ft-f0）/f0，其中T表示当前帧
。 　　在直径38毫米的3毫米高度圆形腔室中进行光遗传学测定 ，并带有倾斜壁。将腔室放置在3毫米厚的丙烯酸板的中间
，悬挂在3×4的627 nm LED（Luxeon Star LED）上方的铝柱上 。将LED连接到金属散热器（Mouser电子）上，该散热器以5 cm的间隔固定到30×30 cm2铝制丝布（McMaster-Carr）
。LED由RCD Power RCD-24-0.70/W/X2驱动器驱动 ，该驱动器由可变的直流电源提供动力。红外LED条（940 nm
，LED灯世界）附着在散热器之间的电线布上，提供了平台的后刷子 。LED条带有071 Tokyo Blue Filter（Lee过滤器） ，以去除照明源发出的潜在激活光
。LED驱动程序由Arduino运行自定义软件的输出引脚控制。使用点灰色Flir grasshopper USB3摄像头（GS3-U3-23S6M-C：2.3 MP
，162 FPS，Sony IMX174 ，单色）从腔室上方监测蝇行为，该镜头行为避免了高升力LED的光线
，以避免识别高级LED的光线 。每秒以30帧记录苍蝇。定制软件用于测定过程中的数据采集和仪器控制
。用光电二极管功率传感器（相干，1212310）测量光强度。在一系列电压输入范围内测量LED（627 nm）的峰值波长 。重复三次测量并平均
。减去LED照明之前的基线强度。 　　在25°C的黑暗和相对湿度为50–65％的黑暗中 ，在标准的SY食品上饲养苍蝇 。p1> UAS-CSCHRIMSON和UAS-CSCHRIMSON对照雄性在ECOLOSEN后不久收集
，组饲养3 d，然后转移到含有0.4 mm的食物中 ，所有转视网膜（Sigma）持续48小时
，然后进行测定
。PPK23-GAL4> UAS-CSCHRIMSON和UAS-CSCHRIMSON对照雄性在Eclosion后不久收集，组饲养3 d ，然后转移到含有0.4 mm视网膜的食物24小时之前
，然后被分析，然后进行测定。Fru∩p1> UAS-CSCHRIMSON ，DSX∩P1> UAS-CSCHRIMSON和UAS-CSCHRIMSON对照雄性在ECLOSION后不久收集
，分组为2 d，然后转移到含有0.4 mm所有反retinal的食物24 h（fru∩p1）或48 h（fru∩p1）或48 h（dsxxxx∩p1）的食物 。目标处女女性为4-6 d
。将苍蝇通过口吸入将苍蝇添加到直径38毫米 ，高度圆形求爱室。一旦男性被转移到装有处女女性的求爱室后，该测定法开始
，并记录了苍蝇的活动10分钟 。通过627 nm波长LED刺激激活表达Cschrimson的神经元
。要激活D. Yakuba中的SplitP1（W; 71G01-AD/+; 15A01-DBD/UAS-CSCHRIMSON）神经元中使用了以下刺激方案：2分钟昏暗的白光，2 min 627 nm LED（5 Hz ，5 Hz
，100 ms脉冲宽度，100 ms脉冲 ，10 µW mm-2）
，可用于10 min总计。为了激活p1（uas-cschrimson :: tdtomato/+; 71g01-gal4/+）神经元在D. erecta中的神经元，刺激方案为：2分钟昏暗的白光 ，然后2分钟627 nm
，然后是5 Hz，100 ms脉冲宽度 ，3.4 µW mm-2 3.4 µW mm-2）代替10分钟总计 。为了激活D. Yakuba中的PPK23+神经元
，使用了以下刺激方案：2分钟昏暗的白光，然后是2分钟627 nm LED（5 Hz ，100 ms脉搏宽度，8 µW mm-2）
，总计10分钟。所有测定均在25°C下进行 启动后0到3 h之间的相对湿度为50–65％
。为了激活D. Yakuba中的FRU∩P1和DSX∩P1神经元，使用了以下刺激方案：2分钟昏暗的白光 ，然后是2分钟的627 nm LED（5 Hz
，100 ms脉冲宽度，FRU∩P1和37 µW mm-2的DSX∩P1的FRU∩P1和37 µW mm-2的DSX∩P1替代10分钟）。48 h视黄醇刺激方案用于每个P1种群的黑色素d. melanogaster雄性 ，使用的光强度为3.4 µW mm -2 。一位盲目的观察者得分
，为了计算整体求爱指数而量化了定向，机翼扩展 ，追逐
，安装和交配，以量化求爱行为
。为了量化动态行为 ，使用FlyTracker（CalTech）跟踪视频。然后使用每种物种的Jaaba（Janelia）对求爱行为行为的行为分类器（对女性的朝向女性和朝向她移动）和单方面的机翼扩展 。 　　在GraphPad Prism 9中进行统计分析
。在分析之前
，测试了使用Shapiro-Wilk方法来确定是否使用参数或非参数统计检验的正态性。在进行多次比较的情况下，如图传说中所示进行了适当的事后测试 。所有使用的统计测试均两尾
。实验者在分析过程中对实验条件视而不见。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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