SARS-COV-2分离株2019-NCOV/USA-WA1/2020
，登录MN985325的GenBank序列于2020年1月24日下载
。总共我们注释了29个可能的ORF和蛋白水解成熟的蛋白质，由SARS-COV-21,12编码。由SARS-COV蛋白酶的蛋白酶特异性预测了由NSP3和NSP5介导的ORF1A/ORF1AB多蛋白裂解引起的蛋白水解产物56 ，然后将16个预测的非结构性蛋白质（NSP）预测（NSP1 – NSP16） 。对于NSP5蛋白酶（3clike/3clpro）
，我们还设计了催化死亡的突变体NSP5（C145A）57,58
。原始GenBank文件中注释的病毒基因组3'端的ORF包括4个结构蛋白：S，E ，M
，N和其他ORFS ORF3A，ORF6 ，ORF6
，ORF7A，ORF7A ，ORF8和ORF10。根据基因组中的ORF的分析
，并与其他注释的SARS-COV ORF进行了比较，我们提供了另外四个ORF：ORF3B ，ORF7B，ORF9B
，ORF9B和ORF9C 。 　　使用IDT密码子 - 优化工具（https://wwwww.idtdna.com/codonopt）将SAR-COV-2基因组注释的ORF和蛋白水解成熟的NSP和内部ECORI和BAMHI站点进行了人类密码子的优化
。在NSPS 1-16中添加了启动和停止密码子，在每个起始密码子之前添加了Kozak序列 ，并将带有链接器的2×strep标签添加到N或C端。为了指导我们的标签策略
，我们使用GPS-脂质来预测Termini（http://lipid.biocuckoo.org/webserver.php）的蛋白质脂质修饰 。（http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)61和Signalp v.5.0预测信号肽（http://www.cbs.dtu.dtu.dk/services/services/services/signalp/)62
。对于所有具有15 bp重叠的读帧的读取框架的IDT gblocks对应于慢病毒本质表达载体plvx-ef1alpha-ires-ires-ires-puro（takara）中的ECORI和BAMHI限制位点的侧翼序列。消化载体并纯化凝胶，并使用输注（Takara）克隆基因片段 。将S蛋白合成并克隆到PTWIST-EF1ALPHA-IRES-PURO（TWIST BIOSCIENCES）中
。NSP16显示出多种突变 ，这些突变无法在本手稿的时间敏感制备之前无法修复
，并且NSP3太大而无法及时合成以至于无法及时纳入本研究。编码NSP3，NSP3（C857A）（催化死亡突变体）和NSP16的链球链球链球链球链将用于未来的AP-MS实验 。 　　HEK-293T/17细胞在Dulbecco的修改后的Eagle培养基（DMEM; Corning）中培养 ，这些培养基补充了10％胎牛血清（FBS； Gibco
，Gibco，Life Technologies）和1％青霉素 - 链霉素（Corning）（Corning） ，并保持在37°C的5％Co2的37°C中。HEK-293T/17细胞是从UCSF细胞培养设施中采集的
，现在通过UCSF的细胞和基因组工程核心获得（（https://cgec.ucsf.edu/cell-cell-cell-culture-and-banking-services）；https://ucsf.app.box.com/s/6xkydeqhr8a2xes0mbo2333i3k1lndqv（cclzr076））
。伯克利细胞培养设施的STR分析于2017年8月8日对HEK-293T/17细胞进行了94％的概率认证。细胞于2019年7月3日使用mycoalert支原体检测试剂盒（LONZA LT07-318）进行了测试，为负：B/A比<1（未检测到的支原体） 。 　　对于每种亲和力纯化（26个野生型诱饵和一个催化死亡的SARS-COV-2诱饵 ，一个GFP对照和一个空的矢量控制），每15厘米盘将1000万个HEK-293T/17细胞铺平
，并在20-24 h后转染15μg单个链球菌标记的表达构建体
。用空载体将总质粒标准化为15μg，并以1：3μg：μL的质粒比：基于制造商的建议 ，将质粒的比率：μl比率为1：3μg：μl：转染试剂。超过38小时后
，使用10 ml Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水在室温下分离，而没有钙和镁和镁（DPB） ，并补充了10 mM EDTA至少5分钟
，然后用10 mL DPBs洗涤 。每个步骤随后在200g，4°C下离心5分钟
。将细胞颗粒冷冻在干冰上 ，并在-80°C下储存。对于每种诱饵
，准备了n = 3个独立的生物学重复，以进行亲和力纯化 。 　　将冷冻的细胞沉淀在冰上融化15-20分钟 ，并重悬于1 ml裂解缓冲液中（IP缓冲液（50 mM Tris-HCl
，4°C，150 mm NaCl ，NaCl，1 mM EDTA）补充了0.5％非IDET P40替代品（NP40; Fluka Analize and phreeptipe and phree）
，phore; fluka Analize andimi edtai and phreie Mini edtaie freepation and phreepation andai freepation a
。抑制剂鸡尾酒（Roche））。然后将样品在干冰上冷冻10-20分钟，并在37°C下部分解冻 ，然后在4°C下在管旋转器上孵育30分钟
，然后在13,000g，4°C离心至15分钟以使颗粒碎片碎片 。保留50μl裂解物后 ，将多达48个样品列入96孔的深螺旋板中
，以在翠鸟柔性纯化系统（Thermo Scientific）上的亲和力纯化，如下：MAGSTREP“ type3”珠（30μl; iba Lifesciences）与1 ml洗涤额（IP Bufferer Adectered）均衡（IBA LIFEESCIENCES）
。0.95毫升裂解液2小时。用1毫升洗涤缓冲液洗涤珠3次 ，然后用1 mL IP缓冲液洗涤一次 。To directly digest bead-bound proteins as well as elute proteins with biotin, beads were manually suspended in IP buffer and divided in half before transferring to 50 μl denaturation–reduction buffer (2 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM DTT) and 50 μl 1× buffer BXT (IBA Lifesciences) dispensed into a single 96-well KF ​​microtitre盘子。首先将纯化的蛋白质在室温下洗脱30分钟
，并在Thermoxer C孵化器上以1,100 rpm的持续摇动
。去除洗脱液后，进行了珠子消化（请参阅“珠子消化 ”）。分别通过蛋白质印迹和银色染色评估了裂解物中链球菌标记的蛋白表达和富集 。翠鸟柔性纯化系统被放置在寒冷的房间中 ，并在使用前将其平衡至4°C过夜
。使用缓慢的混合速度和以下混合时间进行所有自动协议步骤：30 s以平衡和洗涤步骤
， 2小时，用于结合 ，最终珠子释放1分钟。所有步骤之间使用了三个10-S珠收集时间 。 　　将珠子结合的蛋白变性并在37°C下降低30分钟，并在将室温降低后
，在黑暗中用3毫米碘乙酰胺在黑暗中烷基化45分钟，并用3 mm DTT淬灭10分钟
。然后将蛋白质在37°C下孵育 ，最初与1.5μl胰蛋白酶（0.5μg/μl; Promega）一起孵育4小时
，然后再用0.5μl的额外胰蛋白酶再孵育1-2小时。为了抵消蒸发，在胰蛋白酶消化之前添加了15μl50 mM Tris-HCl ，pH 8.0 。所有步骤均以1,100 rpm的持续摇动在Thermoxer C孵化器上进行
。将所得肽与50μl50 mM Tris-HCl
，pH 8.0合并，用于冲洗珠并用三氟乙酸酸化（最终0.5％ ，pH <2.0）。根据标准方案
，使用Biopurespe Mini 96孔板（20 mg原始300 C18；巢组）对酸化的肽进行脱盐进行MS分析 。 　　将样品重悬于4％的甲酸，2％乙腈溶液中 ，并在纳米流C18色谱柱上通过反相梯度分离（Maisch博士）
。将每个样品直接通过易于NLC 1200（Thermo Fisher Scientific）注入Q活性加质谱仪（Thermo Fisher Scientific）中
，并通过75分钟的获取进行分析，所有MS1和MS2光谱都在OrbitRap中收集；使用Thermo Software Xcalibur（4.2.47）和Tune（2.11 QF1 Build 3006）获取数据。对于所有收购 ，QCloud用于控制Project63期间的仪器纵向性能 。使用MAXQUANT（V.1.6.6.11.0）的所有蛋白质组学数据搜索了针对人蛋白质组（下载了UniProt评审序列），EGFP序列和SARS-COV-2蛋白序列（V.1.6.11.0）64,65。将检测到的肽和蛋白质过滤至Maxquant中的1％假发现率
，然后将鉴定的蛋白质与SaintExpress（v.3.6.3）和MIST（https://github.com/kroganlab/mist)15,15,66进行蛋白质与蛋白质相互作用进行评分
。我们应用了两步过滤策略来确定报告的交互式的最终列表，该策略依赖于两个不同的得分严格截止。在第一步中 ，我们选择了所有具有薄雾评分≥0.7的蛋白质相互作用
，SaintExpress贝叶斯错误发现速率（BFDR）≤0.05和平均光谱计数≥2 。对于满足这些标准的所有蛋白质，我们从corum67 Datebase的稳定蛋白质复合物中提取了有关这些稳定蛋白质复合物的信息 ，我们提取了稳定的蛋白质复合物
。在第二步中
，我们放松了严格的性格，并恢复了（1）在滤波步骤1中确定的交互子的其他交互作用 ，并且（2）符合以下标准：雾评分≥0.6
，，≥0.6 ，
， SaintExpress BFDR≤0.05和平均光谱计数≥2。在步骤1或步骤2中满足过滤标准的蛋白质被认为是高信心蛋白 - 蛋白质相互作用（HC-PPIS），并用细胞尺度（v.3.7.1）68可视化 。使用此过滤标准 ，我们几乎所有的诱饵都与先前的数据集恢复了许多HC-PPIS，每个BAIT69平均约为6 ppis
。但是
，对于诱饵的子集（ORF8，NSP8 ，NSP13和ORF9C）
，我们观察到通过这些过滤标准的PPI数量更高。对于这四个诱饵，使用较大的内部数据库进行了薄雾评分 ，这些数据库由87个诱饵组成
，这些诱饵是以类似于SARS-COV-2数据集的方式制备和处理的 。这样做是为了提供更全面的诱饵集合来进行比较，以最大程度地减少非特殊结合背景蛋白作为HC-PPIS的分类
。所有MS原始数据和搜索结果文件已通过DataSet标识符PXD01811770,71通过PRIDE合作库存储库将其存放到ProteOmeXchange联盟中。PPI网络也已上传到NDEX 。 　　测试了每个诱饵的靶标 ，以富集GO生物过程项
。过度代表分析基于高几何分布
，并使用默认参数在R中的clusterProfiler软件包的富集函数进行。GO项是从分子签名数据库的C5类别获得的（MSIGDBV6.1） 。确定了显着的GO条款（1％的错误分辨率率），并进一步完善以选择非冗余条款。为了选择非冗余基因集 ，我们首先根据重要项之间的距离（1 - jaccard相似性系数）构建了一个GO项树
。将GO项树切成特定水平（H = 0.99）
，以识别非冗余基因集的簇。对于属于同一集群的多个重要术语的诱饵，我们选择了最大的术语 ，即最大的基因集大小 。 　　通过比较病原体对之间共享的人际关系蛋白的数量，使用超几何检验来计算显着性来评估相似性
。测试的背景基因由MS在所有病原体中检测到的所有独特蛋白（n = 10,181个基因）组成。 　　ORF6和NUP98-RAE1复合物之间的拟议相互作用是在Pyrosetta 4（版本V.2020.02-DEV61090）72中建模的
，使用VSV矩阵（M）蛋白的晶体结构绑定到NUP98 – RAE1作为A Template32（PDB 4owr; pdb 4owr; dlodation;从pdb-red; pdb-redo server; dlodation 。残基54后将M蛋白链（C）截断，以将模型限制为ORF6中的假定相互作用基序（M蛋白残基49-54 ，序列DEMDTH）
。这些残基使用模块pyrosetta.toolbox中的mutate_isesidue函数将其突变为orf6序列qpmeid
，而无需在此初始步骤中重新包装。在所有六个残基被突变后，使用模块pyrosetta.rosetta.rosetta.protocols.relax中的Fastrelax方案将完整模型放松至低能构象 。Fastrelax的运行受到限制的启动坐标 ，并使用REF2015分数函数得分
。检查了与建模肽残基或与肽相互作用的NUP98和RAE1残基相关的任何大能量惩罚
，并被发现没有任何大的惩罚，发现没有。该模型在Pymol（Pymol Molecular图形系统 ，V.3.4
，Schrödinger）中可视化 。 　　使用JPRED（https://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index.html)74预测ORF10的二级结构
。 　　使用Clustal Omega75对齐来自SARS-COV-2（YP_009724392.1），SARS-COV（NP_828854.1）和BAT SARS样COV（AGZ48809.1）的蛋白E序列 ，并使用Clustal Omega75对齐
，然后手动与H3（P684331）H3（p684331）序列进行手动对齐（YP_308845.1）。 　　为了鉴定调节与SARS-COV-2和HEK-293T/17细胞相互作用的332个宿主因子的药物和试剂（雾≥0.70），我们使用了两种方法：（1）对开源化学数据库的化学信息分析 ，以及（2）A目标和路径特定的文献搜索，在我们组中绘制专业知识 。化学上
，我们从IUPHAR/BPS药理学指南（2020-3-12）55（补充表7）中检索了2,472个分子，该指南与30种人类“猎物
”蛋白质（38个批准 ，71
，在临床试验中的71个）相互作用，并发现了10,883分子（953个培养基试验）（369）。表8）
。对于两种方法 ，分子在其FDA批准状态
，感兴趣的目标的优先级优先于1μm，并且在锌数据库上借鉴了商业可用性。优先考虑FDA批准的分子 ，除非临床候选或临床前研究分子在目标上具有更好的选择性或效力 。在某些情况下
，我们考虑了仅基于文献证据的一般感兴趣途径的间接作用机理的分子（例如，卡托普利通过与血管紧张素转化酶的直接相互作用而间接调节ACE2 ，ACE）
。最后
，我们预测了6个其他分子（2批批准，在临床试验中为1个） ，用于雾评分在0.7至0.6的蛋白质上，以在病毒诱饵之间（补充表4、5）。可以在https://github.com/momeara/biochempantry/tree/master/master/vignette/covid19上找到完整的方法 。 　　使用dock3.779
，将其化学变性分配给Sigma-1受体，将甲状腺菌和棘皮菌对接到受体结合的受体结构（6dk1）78
。显示了离子对与GLU172的最佳评分配置；- 施行者和轻质菌都在-42至-43 kcal/mol之间获得溶剂化校正的对接得分 ，表明互补性很高。 　　对于在西奈山进行的研究
，在VERO E6细胞中传播了SARS-COV-2（来自BEI Resources NR-52281的分离型USA-WA1/2020） 。将两千个E6细胞在DMEM（10％FBS）的96孔板中播种，并在37°C ，5％CO2下孵育24小时
。从ATCC购买了使用的Vero E6细胞
，因此被认证（VERO C1008（Vero 76，Clone E6 ，Vero E6）（ATCC CRL-1586）；在殖民地之前对支原体污染的阴性测试）。然后
，在感染前2小时，将培养基替换为100μL的DMEM（2％FBS） ，其中含有浓度的化合物
，其浓度比指示的50％（包括DMSO对照）大50％ 。这项研究中使用的VERO E6细胞系是肾细胞系
。因此，我们不能排除某些抑制剂的肺细胞产生不同的结果（另请参见“细胞和病毒” ，“抗病毒活性测定 ”，“细胞生存力测定
”和“斑块形成分析”
，以便在Pasteur研究所进行的研究）。然后将板转移到生物安全3级（BSL3）设施中，并将100 PFU（MOI = 0.025）添加到50μL的DMEM（2％FBS）中 ，将最终化合物浓度带到所指示的最终化合物中 。然后将板在37°C下孵育48小时。感染后
，除去上清液，并用4％甲醛将细胞固定24小时 ，然后从BSL3设施中取出
。然后将细胞用于病毒NP蛋白（在García -sastre实验室中产生的抗菌群； 1：10,000）的病毒NP蛋白
，并具有DAPI抗染色。使用Celigo（Nexcelcom）成像细胞仪对受感染的细胞（488 nm）和总细胞（DAPI）进行定量 。感染性是通过病毒NP蛋白在Vero E6细胞核（荧光积累）中的积累来测量的
。将感染百分比定量为（（感染细胞/总细胞） - 背景）×100，然后将DMSO对照设置为100％感染进行分析。使用Prism（GraphPad）软件确定每个实验的IC50和IC90 。对于某些抑制剂 ， 使用TCID50方法对感染的上清液进行传染性病毒滴度测定
。为此
，感染后48小时收集传染性上清液，并在-80°C下冷冻直至以后使用。通过限制对Vero E6细胞的稀释滴定来量化传染性滴度 。简而言之 ，将Vero E6细胞以每个孔为20,000个细胞在96孔板中播种
。第二天
，在10-1至10-6的连续十倍稀释液中应用了含SARS-COV-2-2的上清液，5天后 ，通过用晶体紫罗兰色染色细胞单层来检测到病毒细胞性效应。使用先前描述的方法80计算TCID50/mL值 。根据制造商的说明，还使用MTT分析（Roche）进行了细胞毒性
。在具有相同化合物稀释的未感染的VEROE6细胞中进行细胞毒性
，并与病毒复制测定法同时进行。所有测定均在生物学独立的一式三份中进行 。 　　For studies at the Institut Pasteur, African green monkey kidney epithelial Vero E6 cells (ATCC, CRL-1586, authenticated by ATCC and tested negative for mycoplasma contamination before commencement (Vero 76, clone E6, Vero E6) (ATCC CRL-1586)) were maintained in a humidified atmosphere at 37 °C with 5% CO2, in DMEM containing10％（v/v）FBS（Invitrogen）和5个单位/ml青霉素和5μg/ml链霉素（Life Technologies）。这项研究中使用的VERO E6细胞系是肾细胞系
。因此，我们不能排除某些抑制剂的肺细胞产生不同的结果（另请参见“在存在抑制剂的情况下的病毒生长和细胞毒性测定 ” ，以了解在西奈山上进行的研究）。SARS-COV-2
，分离株法国/IDF0372/2020，由由巴斯德研究所托管的国家参考中心提供 ，由S. van der Werf领导 。X. Lescure和法国Bichat医院的Y. Yazdanpanah提供了分离的BetaCov/France/IDF0372/2020菌株的人类样本
。Betacov/France/IDF0372/2020应变是通过欧洲病毒档案Go Gobal（Evag）平台提供的
，该项目已从欧盟Horizo​​n Horizo​​n 2020研究与创新计划中获得了授予协议，该项目已获得资助。653316 。通过在补充了2％FBS和1μg/mL TPCK- trypsin（Sigma-Aldrich）的DMEM中的VERO E6细胞中传播病毒量
。病毒滴度是通过补充2％（v/v）FBS（Invitrogen）和0.05％琼脂糖的最小必需培养基中的牙菌斑测定确定的。所有涉及实时SARS-COV-2的实验均在批准的实验室中的BSL3遏制程序后 ，在遵守BSL3遏制程序后
，在该研究所的巴斯德研究所进行 。所有实验均在至少三个具有生物学独立的样品中进行
。 　　在实验前18小时，将Vero E6细胞以每孔1.5×104细胞接种。然后 ，在感染前2小时
，将一式三份井的细胞培养上清液替换为含有10μM，2μM ，500 nm，200 nm
，200 nm，100 nm或10 nm的培养基 ，或每种化合物的最大DMSO载体用作对照 。在感染时
，除去含药物的培养基，并用含有TPCK- trypsin（Sigma-Aldrich）的病毒接种物（每个细胞的MOI为0.1 PFU）代替
。在37°C下孵育1小时后 ，去除了病毒接种物
，并加入200μl药物或含有媒介物的培养基。然后，感染后48小时 ，按照制造商的说明
，使用直接 - ZOL-96 RNA提取试剂盒（Zymo），使用细胞培养上清液提取RNA 。使用先前发表的SARS-COV-2特异性引物81通过RT-QPCR进行了提取的RNA中病毒基因组的检测。具体而言 ，引物针对n基因区域：5'-taatcagacaaggaactgatta-3'（正向）和5'-cgaaggtgtgtgacttccatg-3'（反向）
。使用以下循环条件：55°C持续10分钟
，95°C持续1分钟，在10分钟的循环条件下 ，使用Luna通用的单步RT RT-QPCR试剂盒（NEB）进行RT – QPCR。病毒基因组的量表示为PFU等效物，并通过用源自具有已知病毒滴定病毒的病毒量的RNA进行标准曲线来计算 。除了测量源自药物处理细胞的上清液中的病毒RNA外
，通过形成斑块的测定法对传染性病毒进行了定量
。 　　使用Alamar蓝色试剂（Thermofisher）测量了药物处理细胞中的细胞活力。简而言之，处理后48小时 ，除去含药物的培养基并用Alamar Blue代替
，并在37°C下孵育1小时，并在Tecan Infinity 2000 Plate读取器中测得的荧光 。相对于未处理的细胞（100％生存能力）计算了生存能力的百分比 ，并在每个板中包含20％乙醇（0％活力）裂解的细胞
。 　　通过形成牙菌斑的测定来定量病毒。为此
，将Vero E6细胞以每个孔的浓度为7.5×104个细胞中播种在24孔板中 。第二天，加入无血清MEM培养基中单个病毒样品的十倍系列稀释液在37°C下感染细胞1小时
。吸附时间后 ，以2％FBS/MEM培养基和0.05％琼脂糖的最终浓度添加覆盖培养基
，以实现半固体叠加层。将牙菌斑的测定在37°C下孵育3天，然后使用4％福尔马林固定 ，并使用晶体紫罗兰溶液可视化 。 　　如先前所述
，进行了HERG结合测定法
。简而言之，将化合物与HERG膜一起孵育 ，从HEK-293细胞中制备，稳定地表达HERG通道
，[3H] Dofetilide（最终5 nm）在150μl中，在室温下在黑暗中在90分钟内制备。通过将混合物过滤到玻璃纤维上 ，并迅速洗涤3次以去除未结合[3H] dofetilide来制止反应 。过滤器在微波炉中干燥
，用闪烁的鸡尾酒融化，并用塑料膜包裹。在微生物计数器上计算放射性 ，并通过拟合内置的一个结合函数来获得亲和力Ki来分析棱镜的结果
。如先前所述
，进行了毒蕈碱和α-肾上腺素能受体的放射性结合测定。详细协议可在NIMH PDSP网站上找到https://pdspdb.unc.edu/html/tutorials/unc-ch%20protocol%20book.pdf 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。
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