该研究包括20例GBS患者和5例CMT1患者从苏黎世大学医院和卢加诺广州医院（EOC）招募 ，以及从卢加诺瑞士血液捐赠中心（n = 15）获得的21名健康捐助者以及COV-ETH研究（n = 6）。所有参与者均提供了书面知情同意
，以参与​​研究 。这项研究得到了苏黎世伦理委员会（神经模细胞研究，Basec-NR：2016-00929； CoV-ETH研究 ，Basec-NR：2020-00949）和Lugano（IGOS研究，Basec-NR：2018-01860）
。我们纳入了被诊断为AIDP（n = 16）的患者
，以及AMAN患者（n = 4，所有与胃肠炎之前）或CMT1（n = 5）（n = 5）的患者 ，根据国家神经疾病和中风研究所的GBS标准（NINDS）（NINDS）61（扩展数据表1）。具体而言
，我们包括十名AIDP患者，这些患者在Covid-19-19大流行爆发之前进行了采样 ，在疾病发作前的两周到三周中
，潜在的触发器是未知的（n = 6）或与VZV（n = 2）或CMV（n = 2）或CMV（n = 2）相关的 。我们还包括五名患有SARS-COV-2感染的AIDP患者作为先前的触发因素（COVID-19 GBS，在感染后6-20天 ，11±5.4（平均值±S.D.）（扩展数据表1）。该研究中包括的所有AIDP患者均在苏黎世大学医院的高分辨率下一代基于序列的打字中进行了HLA类型（补充表4）
。一名患者（PT16）在2013年还患有Waldenström的大球菌血症
，由于2021年的进展，他接受了同种异体骨髓移植。该患者在2022年患有带状疱疹之前患有带状疱疹 ，在2022年患上了严重的GBS病（移植后一年以上）
，以及较小的轴心疗法疗法疗法，并进行了多余的轴承疗法 。在急性期收集了来自AIDP患者的外周血样本（疾病发作7-36天 ，12.7±9.9 （平均±S.D.）和/或在恢复阶段进行随访（疾病发作的135-509天，244.6±115.7（平均值±S.D.））（扩展数据表1）
。如果有的话
，我们还在疾病发作时获得了CSF（n = 3）。此外，还从一名患者的左疗法神经（PT16）中获得神经活检 。 　　肽在小尺度（1 mg）中合成为粗材料
。该研究中使用的肽包括15人重叠 ，涵盖了P0的整个序列（uniprotkB：p25189-1
，n = 48），p2（uniprotkb：p02689 ，n = 25）
，n = 25）和pmp22（uniprotkb：uniprotkb：q6fh25，n = 30）以及ebmv and p pertiest us cmmv and pept y peptha（ipeptirides）（peptirides）（pept y peptiides）（46 EBV和76 CMV）。在某些实验中 ，我们使用了热灭活的人CMV菌株VR 1814（参考文献62）或涵盖SARS-COV-2蛋白的整个序列的肽池；也就是说
，尖峰域S1（UniprotkB：QHD43416.1，S325和S536-S685氨基酸 ，池S1（ΔRBD）
，91肽），Spike-Domain RBD（uniprotkB：uniprotkB：QHD43416.16.16.1 ，S316-S316 S316 S316 SCICE），44444444444444444444444444444444444444444444444444444-44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444.（UniprotkB：QHD43416.1
，S676-S1273氨基酸，118个肽） ，Nucleocapsid（uniprotkB：QHD43423.2
，82肽），膜（UniprotkB：uniprotkB：QHD43419.1 ，43 Peptides）和Enselvides（uniprotkB：QHD43419.1
，43 Peptides）和Enselvide（Enmelvides）（Enmelvides）;Uniprotkb：QHD43418.1，13肽） 。从Mylan获得了季节性流感病毒疫苗2019/2020
。 　　用Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）分离PBMC。使用CD14涂层的微珠（Miltenyi Biotec）通过阳性选择富含单核细胞 。从CD14 - 细胞分数中 ，记忆CD4+和CD8+总细胞在Facsaria Fusion（BD）上排序超过98％的纯度（BD）
，不包括CCR7+ CD45RA+，CD25Bright ，CD14+和CD56+细胞以及CD8+细胞（用于存储CD4+ T细胞）（以CD4+ CD4+ THERICH）（用于CD4+ CD4+）（用于CD4+ CD4+ CD4+ T）扩展数据图1B
。使用以下荧光体标记的小鼠单克隆抗体进行染色：CD4 – PE/DAZZLE 594（1：500
，克隆RPA-T4），CD45RA – BV650（1：500 ，克隆HI100），CD8 – APC FIRE750（1:80
，CLONE RPA-T8）和CCR70和CCR7-021（1:80）和CCR7-021（1:80） - ccr7-0-bv 7--bv los ccr7--bv。来自Biolegend的G043H7）；CD14 – PE – CY5（1:30，克隆RMO52） ，CD25 – PE – CY5（1:30
，克隆B1.49.9）和CD56 – PE – CY5（1:30，克隆N901 ，n901）来自贝克曼·库尔特（Beckman Coulter）；BD Biosciences的CD19 – FITC（1:20
，克隆HIB19）和CD25 – PE（1:20，克隆M-A251） 。将细胞在冰上染色15-20分钟 ，然后在Facsaria Fusion（BD Biosciences）上排序。在抽样的几个小时内
，将神经活检样品切碎，然后通过40μm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬浮液
。通过腰穿点收集CSF样品（1-2 mL）。在存在辐照（45 Gy）同种异体饲料细胞（每孔1×105）和IL-2（500 IU ML-1）的情况下 ，将来自神经活检或CSF的细胞与1μgml-1 PHA（REMEL）刺激 。在第15天
，将扩展的T细胞用CD3 – BV785（1：100，克隆UCHT1）和CD4 – PE/DAZZLE 594（1：500 ，克隆RPA-T4）抗体染色，来自Biolegend和CD8 – FITC（1:30
，Clone B9.11）和CD56 – Pe-Pe-cy5（1:30 ccy5（1:30）（1:30）Coulter和CD3+CD4+CD8 -CD56-或CD3+CD8+CD4 -CD56- T细胞在Facsaria Fusion（BD Biosciences）上排序
。 　　将T细胞培养在补充有2 mM谷氨酰胺，1％（v/v）非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中 ，1％（v/v）丙酮酸钠
，青霉素（50 U mL-1），链霉菌素（50μgml-1）（50μgml-1）（来自Invitrogen）（所有来自Invitrogen）和5％的热 - 人类杂种和5％的热 - 含量（5％）和5％的热 - 含量。Ex vivo sorted memory CD4+ and CD8+ T cells or EM and CM memory CD4+ T cell subsets (PT16) from the blood as well as in vitro expanded and sorted CD4+ T cells from CSF or nerve biopsy were labelled with CFSE and cultured at a ratio of 2:1 with irradiated autologous monocytes untreated or pulsed for 1 h with selected peptide pools from P0,P2和PMP22（每肽3μgml -1）或对照抗原反射V（5μgml -1）或EBV或CMV（1μgml -1） 。六天后 ，将细胞用Biolegend的CD25-PE（1:20
，克隆M-A251）和ICOS-太平洋蓝色（1：100，克隆H4A3）染色
。根据（i）刺激指数≥2的截止值（抗原和APC/％仅具有APC的CFSELOW细胞的百分比） ，对T细胞响应的评分为阳性。通过分析的各种供体在各种供体中通过EX VERO T细胞刺激技术评估的样品 。 　　为了隔离自动反应性T细胞克隆
，如前所述29，对离体培养物中的CFSelowCD25+ ICOS+ T细胞进行了分类并克隆 ，并克隆到克隆中
。通过用辐照的自体B细胞刺激未处理或脉冲1小时
，用P0，P2或PMP22肽池（每肽3μgmL -1）刺激T细胞克隆。为了确定MHC限制 ，在不存在或存在阻断抗MHC II类单克隆抗体（10μgml-1;抗HLA-DR，克隆L243; Anti-HLA-DQ
，Clone-DQ，Clone SPVL3; Anti-HLA-DP ，抗HLA-DP
，Clone B7/21）的情况下进行测定 。在SARS-COV-2或CMV抗原的交叉反应性实验中，用P0 ，P2
，P2或PMP22肽池（3μgML-1）或每次pp肽池（3μgml-1）刺激T细胞克隆用辐射的自体B细胞刺激T细胞克隆，或者每次pp22肽池（3μgml-1） ，或者每次pepect-2μgmML-1 pective cortriv treative closs clone（3μgml-11814（2.5μgml -1）（参考文献62）
。表位映射实验是通过用辐照的自体B细胞刺激自动反应性T细胞克隆在用单个15-Mer重叠肽（每肽3μgmL-1）脉冲后
，覆盖整个P0，P2 ，P2或PMP22蛋白质长度。在所有实验中
，在与1μCIML-1 [甲基-3H] - 胸腺胺（Perkin Elmer）孵育16小时后，在第3天测量增殖 。常规测试细胞系以排除支原体污染。 　　为了定量自身反应性T细胞克隆释放细胞因子 ，用辐照的自体B细胞刺激细胞，未处理或暴露于P0
，P2或PMP22肽池（每肽3μgml -1）
。根据制造商的说明，使用预定义的人类T辅助细胞因子面板版本2（Biolegend） ，通过LegendPlex多重珠的免疫测定法对48-H培养上清液中释放的细胞因子进行了定量。使用FACS LSR Fortessa（BD Biosciences）获取数据
，并使用LegendPlex（Biolegend）的数据分析软件套件进行了分析 。 　　对于细胞内细胞因子染色，在过去2.5 h培养的培养物中 ，在存在Brefeldin A（全部来自Sigma-Aldrich）的情况下
，用Phorbol-12-Myristat-13-乙酸（PMA）和离子霉素将自动反应性T细胞克隆重新刺激
。用活/死固定的水染料（Thermo Fisher Scientific）对细胞进行染色，然后根据制造商的说明固定并用细胞膜/细胞处理（BD Biosciences）纠正并透化。After fixation, cells were stained with anti-granzyme A (1:50, clone CB9), anti-granzyme B (1:50, clone QA18A28), anti-perforin (1:50, clone dG9), anti-TNF (1:160, clone MAb11), anti-IL-10 (1:50, clone JES3-9D7) and anti-IL-17A（1：400 ，克隆BL168）全部来自Biolegend；来自BD Biosciences的抗IFNγ（1：160
，克隆B27）和抗IL-4（1：100，克隆MP4-25D2）；和Anti-IL-22（1:50 ，克隆22urti
，Thermo Fisher Scientific），与不同的荧光染料结合 。使用BD FACS Diva（V.9.0）在FACS LSR Fortessa（BD Biosciences）上获取细胞 ，并使用FlowJo v.10.8.1软件（FlowJo）分析流式细胞仪数据
。 　　用P0，P2和PMP22抗原（PNS-膜蛋白抗原）或流感疫苗（流感流感）的混合物（p0
，p2和PMP22抗原（PNS-Myelin抗原））在体外刺激后，对两名AIDP患者（PT2和PT16）的记忆CD4+ T细胞进行了SCRNA-SEQ分析。将细胞与与人通用抗体（样品标签 ，BD单细胞多路复用试剂盒）结合的独特寡核苷酸条形码孵育
，以回溯每个细胞的原始病人和患者 。对于每种条件，对抗原反应性CFSelow和非反应性-CFSEHIGH T细胞进行了facs排序以检索总细胞数 ，然后在单个管中以1：1的比率合并
，以使用BD Rhapsody Express单细胞单细胞分析系统进行进一步处理
。简而言之，按照制造商的说明 ，将细胞用活力模具标记
，并加载到BD Rhapsody弹药筒上。随后在BD狂想曲扫描仪中分析了墨盒，以获得总细胞的估计并验证其生存能力 。用基于重力的 ，珠子辅助的微孔技术捕获单细胞捕获后
，我们根据制造商的协议将整个转录组，TCR库和样本标签库放大
。我们使用Illumina NextSeq 500系统对功能基因组中心（FGCZ）的功能基因组中心（FGCZ）进行了测序。详细说明 ，我们为WTA库对每个单元格进行了20,000次读取，每个单元格的TCR库读取了5,000个读取
，每个单元格的读数为示例标记库的每个单元格1,000个读取 。我们使用Sevenbridges在线平台对参考基因组“ HOMO_SAPIENS_GENCODE_GRCH38-P13_RELEASE_37-2021-05-04’”进行读取对齐，并生成用于下游分析的功能 - 核模型矩阵。计算分析使我们能够将患者 ，状况
，TCR和整个转录组信息分配给分析的每个单元
。在质量控制之后，涉及过滤低质量的细胞和细胞双线或倍数 ，以及线粒体计数的细胞高于5％
， 我们在数据集中的前2,000个高度可变特征上对数据进行了归一化，并执行了缩放率 ，降低尺寸降低和聚类（Seurat v.4.9.9.9059）。我们总共获得了1,980个细胞（PT2急性
，n = 608; PT2恢复，n = 262; pt16急性 ，n = 1,110）
，从用PNS-膜蛋白抗原和2,232细胞刺激的培养物中，n = 1,110）（pt2急性 ，n = 287; pt2恢复，n = 224;疫苗 。后来
，我们根据激活和增殖基因的表达水平25,26分配了簇，以定义抗原特异性和非特异性簇
。抗原反应性T细胞簇包含413个PNS-膜蛋白反应性（PT2急性 ，n = 181; PT2恢复
，n = 40; PT16急性，N = 192）和414流感反应性的单T细胞（Pt2和242个单个TCRα/β克隆型（数据未显示）。我们结合了急性和恢复数据集 ，并比较了先前与不同T辅助子集和细胞细胞毒性相关的基因签名的表达水平63,64,64,65,6666,67,68,69（所有seurat v.4.9.9.9.9059）
，然后使用软件包进行了富含基因套件的分析，并进行了软件包分析 。https://github.com/ncborcherding/escape)70使用r v.4.2.1
。 　　为了确定自动反应性T细胞克隆的TCRVβ序列 ，从103-104细胞中获得总cDNA
，并在建立的方案后进行了TCR测序29。简而言之，在含有0.2％Triton ，dntps和RNase抑制剂的反应混合物中
，使用HPLC纯化的寡核DT（25）引物（25）引物（25）引物（25）和最大值逆转录酶（Thermo Fisher Scientific）进行了反应 。反应在以下条件下进行：50°C×60分钟；55°C×5分钟
。将五个微量的cDNA添加到含有Q5热启动高保真DNA聚合酶（新英格兰Biolabs）的PCR混合物（最终体积25μL）中。如先前所述29，使用TCRVβ特异性正向引物池扩增TCRVβ序列 ，并将反向引物配对与恒定区域进行配对 。通过琼脂糖凝胶电泳评估序列扩增
。通过Sanger方法对成功的扩增片段进行了测序，并使用IMGT/V-Quest算法进行TCRVβ序列注释。 　　对TCR的深度测序是对从PMBCS分类的CD4+记忆T细胞进行了从CSF或CSF或神经活检的体外分类和分类的CD4+ T细胞以及PNS-Myelin反应性T细胞富集的CD4+ T细胞（2.5×105-5-5×105×105×105×105×105） 。简而言之
，根据制造商的说明，将细胞在PBS中洗涤 ，并使用QIAAMP DNA微试剂盒（Qiagen）从沉淀中提取基因组DNA。如先前所述
，使用免疫系统测定法进行了TCRVβ的测序
。简而言之，在旨在靶向任何CDR3Vβ片段的多重PCR反应后 ，使用Illumina HISEQ平台对扩增子进行了测序。由所有检索的87个核苷酸或相应氨基酸序列以及包含CDR3区域的序列组成的原始数据被输出并进一步处理 。每种TCRβ克隆型被定义为核苷酸序列的独特组合
。使用Immunoseq Analyzer v.3.0（http://www.immunoseq.com）和R包装Immunarch v.0.9.0（https：//github.com/immunoMind/immmind）提供的Immunoseq分析仪V.3.0（http://www.immunoseq.com）提供的模板的生产频率进行了数据处理。 　　通过生物认同重叠鉴定出每个供体库中的抗原特异性TCRβ克隆型
，定义为相同鉴定的V基因，CDR3β区的氨基酸序列 ，并鉴定出J基因 。分析的样品在扩展数据表2中列出
。将共享TCRβ克隆型的累积频率计算为在相应患者的TCRVβ库中每个TCRβ克隆型的频率之和。根据Immunoseq分析仪V.3.0或IMGT/V-Quest算法的总生产重排计算CDR3β长度 。 　　The GLIPH2 algorithm32,71 from the HetzDra/turboGliph v.0.99.2 R package (https://github.com/HetzDra/turboGliph/) was used to identify lymphocyte interaction by paratope hotspots and predict specificity groups, herein referred as clusters, on the basis of global or local similarity (convergence).TCR全球收敛依赖于TCR之间的CDR3锤量距离；即
，两个TCR中CDR3区域内不同氨基酸残基的数量具有相同的长度并共享相同的Vβ段
。TCR局部收敛依赖于基于共享的CDR3氨基酸基序（2mers，3mers ，4mers和5mers）在任何给定的T细胞受体中（> 10×折叠富集
，概率<0.001）。值得注意的是，如果计算相似的计算 ，则允许将TCR分配给多个群集 。GLIPH2分数是由一组特征的概率组合产生的，然后通过汇合将其合并为单个分数
。此类功能包括全局相似性概率
，本地主题概率，网络大小；V基因在簇中的富集 ，簇中CDR3长度的富集
，簇中克隆膨胀的富集以及从捐助者促成群集的TCR中的共同HLA等位基因的富集。GLIPH2算法通过162,165CDR3β序列的参考数据集训练，并且查询样本量应与训练SET32,71的大小相当 。因此 ，我们对不同的患者和队列进行了多轮分析。我们对来自GBS患者血液（n = 10）的总记忆CD4+ T细胞的TCRVβ库进行了GLIPH2分析
，并通过疾病期分组
。详细介绍，我们分析了急性期（PT1 ，PT2
，PT5，PT7 ，PT7
，PT10，PT11 ，PT12；总计：82,826 TCRVβ序列）的七个样本和恢复阶段的八个样本和八个样品（PT1，PT2
，PT2，PT4 ，PT4
，PT5，PT7 ，PT7
，PT7，PT9 ，PT9
，PT1，PT1 ，PT13；回合）。我们还对PT16（来自急性期EM和CM T细胞群体的PNS-膜蛋白特异性CD4+ T细胞的CFSelow富集）的分析进行了分析；总计：568 TCRVβ序列）以及已发表的TCRVβvβvβ的存储CD4+ T细胞的TCRVβ数据集来自健康的供体（n = 9; c5
，C11; C5，c6 ，c6，c6
，c6，c6 ，c11; c6; c6; c6; c6;C15;总计：149,939个TCRVβ序列
，两轮）27,28,29 。此外，我们将GLIPH2分析应用于总CD4+ T细胞的TCRVβ曲目 ，从GBS患者的CSF（n = 3; PT10； PT11
，PT11，PT12；总：2,525 TCRVβ序列）扩展
。体外刺激后从血​​液中分离出的PNS膜蛋白特异性记忆CD4+ T细胞的TCRVβ序列（PT16）和CSF和神经活检（PT16）的总CD4+ T细胞在GLIPH2计算的一轮中一起分析。最后 ，我们对两名GBS患者的SCRNA-SEQ实验的TCRVβ库进行了另一轮GLIPH2分析（PT2和PT16；总计：1,733个独特的TCRVβ序列） 。详细介绍
，在用PNS-膜蛋白抗原或流感疫苗刺激六天后，对来自非特异性CD4+记忆T细胞的526个TCRVβ序列进行了526个TCRVβ序列
。在每一轮分析中 ，我们包括从GBS患者的血液中分离出的自动反应性TCRβ克隆型（n = 167
，其中n = 18在记忆CD4+ T细胞中共享几个患者的TCRVβ曲目）。如果群集包括一种已知特异性的自动反应性TCRβ克隆型，并且由多个GBS共享 ，则认为它们是相关的 。如果可以在不同组之间的GLIPH2分析中确定相同的群集（例如，GBS急性
，GBS恢复或健康的供体），则将视为一个集群 ，但将维护标识符代码以保留位置信息 （补充表5）
。 　　GBS患者携带的HLA等位基因与通过表位映射确定的PNS膜肽肽携带的HLA等位基因之间的结合亲密预测是使用DTU卫生技术部提供的NetMHCiipan-4.0服务器进行的
，这是通过表位映射确定的。简而言之，人工神经网络经过了超过半百万的结合亲和力实验测量 ，并洗脱了涵盖人类HLA-DR
，HLA-DQ和HLA-DP的配体质谱 。当指示有关感兴趣的HLA亚型和选择的肽（15-氨基酸肽）的指示时，它可以预测肽自然呈现的可能性 ，其预测的亲和力
，并且该肽与一组随机肽相比，该肽的可能性
。从Netmhciipan-4.0中 ，我们推断了每个已知携带公共TCRβ克隆型的HLA等位基因的结合亲和力与这些公共TCRβ克隆型识别的特定表位。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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