耕种和野生的水稻加入全部来自中国杭州国家水稻研究所的大量水稻加入 ，以及日本米西马的国家遗传学研究所。根据表型数据的种质数据库记录和采样位置选择加入 ，以最大程度地提高遗传和地理多样性 。该系列是通过实验室中的自我维护的 。对于每个登录，都将来自单个植物的基因组DNA进行测序 ，并且使用同一植物衍生的种子用于以下试验。总共在Illumina Genome Analyzer IIX上测序了1,083 O. sativa的加入 ，446 O. rufipogon加入和15种外群物种的加入，生成了73 bp（或117 bp）成对的末端读数 ，每个读数为O. sativa for.sativa offoffofore（O. sativa for o. sativa consections o... o...o..o. o..O.O.O.O.O.O 。物种）覆盖范围 。补充表2、7和8中列出了详细信息 ，包括地理起源和水稻加入的测序覆盖范围。如上所述，对这些加入的库构建和测序进行了测序21 。在Illumina Hiseq2000上测序了O. Rufipogon（W1943）的一个代表性登录 ，生成了100 bp配对的读数 ，具有100倍的基因组覆盖范围 。在水稻登录的深层测序中使用了一种无扩增的图书馆制备方法，从而降低了重复序列的发生率，从而促进了基因组组装和变异分析。
使用软件Smalt（0.4版）和“ -pair 50 、700”和“ -Mthresh 50 ”的参数 ，将所有大米配件的配对末端读取与大米参考基因组（IRGSP 4.0）对齐 。使用SSAHA PITEP软件包（0.5版）调用SNP ，并具有先前描述的详细过程21 。大米饰品的基因型，包括1,083个O. sativa饰品 ，446 O. rufipogon饰品和15种外群物种的加入 ，在SSAHA堆积输出中进一步召集了SNP站点。使用群体外种物种15个加入中的基因型调用来确定O. sativa和O. rufipogon中SNP的祖先状态。然后，根据RAP-DB中的基因模型定义了编码区域的SNP（版本2） ，然后注释为代名词或非同义词 ，用于计算非同义/同义/同义比率和DN/DS比率 。1,529个大米垫（1,083个O. sativa饰品和446 O. Rufipogon加入）的基因型数据集是根据每个水稻加入的调用而生成的 。七组基因组序列包括基于细菌的人工染色体序列序列和高覆盖的重新覆盖数据，用于评估基因型数据集的准确性（补充表6）。选择了带有测序覆盖率> 9的野生水稻饰品 ，以根据对齐到参考序列的重叠读数来研究杂合性 。对于每个登录 ，在多态性位点计算了杂合性基因型的比例（补充表3） 。
该软件Haploview用于使用与446 O. Rufipogon Accessions 50中信息的SNP一起计算与默认设置的链接不平衡。计算所有SNP的成对R2，然后在整个基因组中平均 。来自简单SNP匹配系数的成对遗传距离的矩阵用于使用软件Phylip51（版本3.66）来构建系统发育树 。软件TreeView和Mega5用于可视化系统发育树。使用软件Eigensoft52进行了SNP的主成分分析 。使用100 kb窗口计算序列多样性统计（π）和种群分化统计量（FST） 。分别计算了O. rufipogon和O. sativa中的每组的π值 ，并且在O. rufipogon的全部种群（或每个进化枝）中 ，O. rufipogon与O. sativa的完整种群（或相应的亚种）中的π的值分别计算了π。O. rufipogon和O. sativa均显示出低水平的遗传多样性的基因组区域被排除在外 。为了采用适当的阈值以降低假阳性速率，但也保留了真实的选择信号，根据已知基因座的全基因组置换测试和信号选择阈值 。进行置换测试以估计全基因组I型错误率 ，并确定调用选择性扫描的阈值（有关详细信息 ，请参见补充信息第2节）53。还测试了使用软件XPEHHH54（http://hgdp.uchicago.uchicago.edu/software/）测试了方法交叉构造扩展单倍型（XP-EHH）检测选择性扫描（补充图20）。基于成对遗传距离的基质计算两个进化枝之间的遗传距离，在该基质中 ，取回和平均所有登录与两个进化枝的距离 。开发了一个自定义perl脚本来绘制所有O. rufipogon配件 ， 使用“主题映射 ”数据集（版本0.3）中世界边界的公共地理信息 。使用程序SFS_Code40进行了不同人口统计场景下的计算模拟。
对于O. rufipogon人群，从2011年3月 ，从野生大米收集的每个加入的大约五个种子都发芽并种植在实验领域（在中国的Sanya ，中国，n 18.65° ，E 109.80°） 。从观察到叶片鞘颜色 ，直接测量并直接测量每种工厂的tiller角 。210个反向杂交线（BIL）和61个染色体段替代品（CSSL）的映射种群源自O. sativa ssp之间的一个十字。Indica CV 。Guangluai-4和O. Rufipogon登录W1943 。bils是由一代反向广告-4发育而来的，随后是六代自我施用。CSSL由五代后越过广卢伊-4开发 ，其次是三代自我施用 。Phenotyping was conducted in the experimental field (in Shanghai, China at N 31.13°, E 121.28°) from May to October, 2011. The fifteen traits that we phenotyped for this study include germination rate, tiller angle, heading date, stigma colour, the degree of stigma exsertion, plant height, panicle length, the degree of shattering, awn length, grain number per panicle, grain length, grain宽度 ，每1,000粒，船体颜色和果皮颜色 。根据观察到每条线的20个随机采样尖峰的观察，对柱头的遗传程度进行了评分 ，尺度为1-3（否 ，不完整或完全的劳累）。通过使用成熟的种子在黑暗中将30°C放置在30°C的塑料培养皿中，测量种子发芽速率48 h5 。如先前所述21,22,29 ，对其他特征进行了表型和评分 。
对于O. rufipogon中的基因型数据集 ，在O. rufipogon种群中，在500万个SNP位点专门调用了446 O. rufipogon的基因型。在GWAS的面板中 ，只剩下一个超过5％的次要等位基因频率（MAF）并包含100多个加入的基因型调用的SNP才能进行后续插补。基于K-Neart的邻居算法的插补方法用于推断缺失的呼叫21 。使用三组基因组序列评估了归因之前和之后基因型数据集的特异性（补充表6） 。使用压缩混合线性模型55进行了关联分析。前五个原理成分被用作固定效应 ，并使用遗传距离的矩阵来对随机效应的方差 - 稳定矩阵进行建模 。使用置换测试来定义野生水稻种群中GWA的关联信号的阈值 。总共进行了20个置换分析（对两个性状的每个特征，鞘颜色和分er角进行了10个独立的置换测试） ，这导致了我们SET53的阈值两个“关联信号”。因此 ，在单个全基因组扫描分析中，平均有0.1个假阳性（即20个排列测试中的两个假阳性） 。使用仿真测试比较栽培和野生大米种群之间GWA的性能 。
在Illumina基因组分析仪IIX上测序了映射群体中每一系的基因组DNA ，每个基因组分析仪iix均约为0.5倍。在先前的工作21和这项研究中 ，对人口的父母（广泛4和W1943）进行了至少20倍的基因组覆盖范围 。如前所述41进行了父母之间的SNP识别 。使用软件SEG-MAP（http://www.ncgr.ac.ac.cn/software/seg/）进行基因型调用，重组断点确定和bin地图构建。对15个特征的QTL分析是通过在软件Windows QTL制图仪56（版本2.5）中实现的复合间隔映射（CIM）方法进行的，其窗口尺寸为10 cm ，步骤尺寸为2 cm 。调用LOD值高于3.5的QTL ，根据其LOD峰位置描述了该位置 。使用Windows QTL制图师计算每个QTL的表型效应（R2）。位于选择性扫描区域内的QTL进一步用于将所选区域与其生物学功能相关联。需要注意的是，我们在QTL调用（LOD> 3.5）中采用了一个严格的阈值 ，并且LOD的基因组区域范围为2.5至3.5 ，可能包括许多次要QTL（在大多数研究中，阈值设置为2.5） 。
W1943的基因组是通过使用自定义管道集成Phusion2（将原始读数聚类到不同组中）和PHRAP（然后组装每个组中的所有读数以生成CORTIGS）58来组装的 。计算整个组件的N50长度 ，该重叠群的小重叠群不包括200 bp。W1943的所有全长互补DNA序列46均与W1943基因组序列的最终组件使用软件GMAP59（版本6）和“ -K 15000 ”和“ -K 0.97 ”对齐 。使用软件Mummer60（版本3）将全基因组从头组装产生的重叠群固定在水稻参考基因组序列（IRGSP4.0）上 。
使用为Monocot Model61（版本2.0）设置的软件FGenesh预测了野生水稻W1943基因组的基因模型。使用BLASTP将W1943的蛋白质组与水稻基因组注释项目（版本7.0）中的蛋白质序列进行了比较 ，其截止性最低为95％ 。序列变体，包括SNP ，Indels和不平衡取代 ，使用Packoss Package62中的DiffSeq程序调用 。从木乃伊的比对结果调用了大尺寸的indels。根据RAP-DB中NipponBare的基因模型（释放2），预测了序列变体的效果 。对于在驯化基因座周围具有较大作用的基因区域和SNP中的indels ，其影响主要基于参考基因模型 。
然后使用相同的参数与参考NipponBare基因组序列对齐 ，将1,083 O. sativa辅助，446 O. R. rufipogon登录和15个外组辅助的序列读取与W1943的组装基因组序列对齐。根据两个基因组序列的比对输出，在所有序列变体位点（包括从组装序列中检测到的SNP ，Indels和不平衡取代）调用每个登录的基因型 。计算序列变体位点的等位基因频率 ，为O. sativa和O. rufipogon的每个进化枝计算 。在每个进化枝中，随后将具有少于10个加入信息的信息（少于2个）信息进行计算等位基因频率的变体站点被排除在外 ，即没有可用的数据。
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希望本篇文章《水稻基因组变异图揭示了栽培水稻的起源》能对你有所帮助！
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